新型双功能褐藻胶裂解酶构效关系分析及在褐藻寡糖制备中的应用

2019-04-29 08:34

文章背景简介

BACKGROUND INTRODUCTION

褐藻胶是海带等褐藻细胞壁的主要成分，它是一种由β－D－甘露糖醛酸（M）及α－L－古尔糖醛酸（G）组成的线性多糖。它由三种不同的单元组成，即聚β－d－甘露糖醛酸（polyM）、聚α－l－古龙糖醛酸（polyG）和杂聚物（polyMG）。海藻酸钠具有良好的化学性质和多种活性，且来源丰富、成本低廉，在食品和医药工业中得到了广泛的应用。但由于分子量大、生物利用度低，褐藻酸盐的应用受到很大限制。近年来，褐藻胶的降解产物褐藻寡糖由于具有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤的生物活性和良好的溶解性，受到越来越多的关注。

褐藻胶裂解酶是广泛存在于海洋微生物、土壤微生物、噬菌体、病毒及海洋软体动物体内的一种可通过β－消除作用将褐藻胶降解为不饱和寡糖的酶类。根据蛋白质序列相似性，褐藻胶裂解酶被分在PL－5、6、7、14、15、17和18家族。根据其底物特性，海藻酸钠裂合酶可分为G区特异性裂合酶（polyG裂解酶）和M区特异性裂合酶（polyM裂解酶）。而根据作用方式，则可分为内溶型和外溶型。内溶型可以识别并裂解糖苷键将褐藻胶分解成二糖、三糖、四糖等不饱和低聚糖，而外溶型则可以进一步将低聚糖降解为单体。

2019年，南京工业大学Zhu B等人在《Biotechnology for Biofuels》（IF＝5．497，工程技术1区）上发表了题为“Elucidation of degrading pattern and substrate recognition of a novel bifunctional alginate lyase from Flammeovirga sp． NJ－04 and its use for preparation alginate oligosaccharides”的文章。Flammeovirga sp．NJ－04是一种从深海中分离出的可以降解褐藻酸盐的菌株，研究已发现其中含有可以降解褐藻酸盐的基因簇。该研究从这一菌株中克隆鉴定了一种新的PL7家族双功能褐藻胶裂解酶FsAlgB。与PL7家族的大多数褐藻胶裂解酶一样，它能以内溶方式将褐藻酸降解为低聚糖。据报道，PL7家族中鞘氨醇单胞菌的A1－II′表现为β－夹心果冻卷折叠（β－sandwich jelly roll－fold）结构，它可以与四糖底物结合水解成二糖和三糖。与四糖结合的A1－II′结构表明，Gln189和Arg146是底物羧基的中和剂，此外还有作为广义碱的His191以及作为广义酸的Tyr284。然而，目前PL7家族酶的底物降解模式尚不清楚。本文对FsAlgB的降解方式、生化特性、作用方式及产物特征进行了分析研究。

所用到的主要方法

METHODS

1．质粒构建及表达

2．HiTrapTM脱盐

3．SDS－PAGE

4．紫外吸收法测酶活

5．ESI－MS

6．TLC薄层色谱

7．分子模型及对接分析

文章主要内容摘要

ABSTRACT

背景：褐藻寡糖是一种具有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤等多种生理功能的低聚糖，在农业、医药和食品工业中得到广泛应用。双功能海藻酸裂合酶能更有效地将褐藻酸多糖降解为褐藻寡糖。因此，寻找新的双功能褐藻酸裂合酶是生产褐藻寡糖的关键。

结果：本文从深海细菌Flammeovirga sp．NJ－04中克隆并鉴定出了一种新的双功能褐藻酸裂合酶FsAlgB，其在pH8．0和40℃下具有广泛的底物特异性及高活性（1760．8U／mg）。并且，FsAlgB对polyG（0．69mM）和polyMG（0．92mM）的Km值低于对海藻酸钠（1．28mM）和polym（2．06mM）的Km值。重组表达FsAlgB后，进一步鉴定其为一种内溶性褐藻胶裂解酶，它可以识别的最小底物为四糖，并能裂解其？3到＋1亚基之间的糖苷键。

结论：本研究为具有广泛底物特异性的海藻酸钠裂合酶的底物识别和降解模式提供了更深入的见解。