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文章背景简介

BACKGROUND INTRODUCTION

毕赤酵母常用于表达外源蛋白，是一个理想的细胞工厂，因为它能够达到非常高的细胞密度，并将蛋白质分泌到上清液中，并且毕赤酵母本身分泌的天然蛋白质较少，简化了下游纯化的工艺。增加同源基因的拷贝数量可以使外源蛋白的产量增加。然而，由于蛋白在分泌途径中会达到饱和，多拷贝克隆和外源蛋白表达两者之间的关系并不是线性的。因此，研究中需要测定具有不同拷贝数的菌株，以确定蛋白表达量最大的菌株。因此，需要一种快速、简便的方法来产生具有一定基因拷贝数的菌株。

目前，产生多拷贝克隆的实验方法有几种，包括转化前载体的体外多克隆、利用高浓度抗生素直接筛选转化子等。采用直接选择法，在含有较高浓度抗生素的平板上产生的菌落数量往往大大减少，从而会限制获得的多拷贝菌株的数量。由于直接选择法生成多拷贝克隆的效率较低，2008年Sunga等人提出了转化后矢量放大的方法（PTVA）。在PTVA中，细胞不是在平板上直接使用高浓度的抗生素来筛选，而是随着抗生素浓度的增加来进行筛选，随着细胞抗生素耐药基因的拷贝数增加，使细胞适应更高的抗生素浓度。

PTVA已被广泛应用于毕赤酵母，然而，尽管PTVA比较容易操作，但该方法费时费力。2016年2月5日，伦敦帝国学院（Imperial College London）的Rochelle Aw 和Karen M． Polizzi等人，在《Microbial Cell Factories》杂志（当前IF4．402；工程技术2区）发表了题为“Liquid PTVA： a faster and cheaper alternative for generating multi－copy clones in Pichia pastoris”的文章，描述了一种通过在液体介质中连续传递来减少PTVA时间和成本的方法，这种方法能够很好的获得包含不同拷贝数的菌株。

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所用到的主要方法

METHODS

1．转换后矢量放大技术（PTVA）

转换后矢量放大技术（PTVA）是指细胞不是直接通过高浓度的抗生素来进行筛选，而是随着抗生素浓度的增加来筛选多拷贝的一种方法。在筛选的初级阶段，抗生素耐药基因的拷贝数增加，使细胞适应更高的抗生素浓度。因此，在较高的抗生素浓度下存活的菌株也含有较高数量目的基因的完整副本。

2．Q－PCR

3．分光光度法

4．载体构建

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文章主要内容摘要

ABSTRACT

背景：为了提高毕赤酵母重组蛋白表达的产量，研究人员经常使用多个同源基因拷贝克隆的方法。转化后矢量放大技术（PTVA）可以有效地在毕赤酵母中生成多拷贝克隆。然而，尽管这种方法相对容易操作、成功率较高，但是这个过程时间周期比较长，与此同时也会花费较多的金钱。

结果：本文开发了一种改良版的PTVA，称为液体PTVA，这种方法克服了传统PTVA（在固体培养皿筛选）的缺点，能够更快、更便宜地选择多拷贝克隆。转化后的细胞是在液体培养基中培养的，只是最后的筛选是在琼脂平板上进行的。这种方法不仅减少了抗生素总体的使用情况，而且提高了克隆扩增的速度。此外，该研究还发现：以单一拷贝的菌株来进行筛选可使两种PTVA（传统平板筛选和液体筛选）产生更高的拷贝数菌株。另外，在液体PTVA中使用Zeocin作为筛选抗生素，可以获得生长速度较高的菌株。

结论：本文创建了一种多拷贝克隆方法——液体PTVA，这种方法可以在12天内完成，而不是传统的45天，而且花费的成本大约只有先前方法的一半。

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一种新型无标记、多拷贝毕赤酵母过表达载体的构建与应用