毕赤酵母高效表达热稳定性褐藻胶裂解酶及其在生产褐藻寡糖的应用

2019-10-10 08:56

文章背景简介

BACKGROUND INTRODUCTION

褐藻胶是由β－D－甘露糖醛酸（M）及其C5差向异构体α－L－古罗糖醛酸（G）通过α／β－1，4糖苷键随机排列而成的一种酸性多糖，这两种糖单元相互聚合形成三种不同的结构单元：聚甘露糖醛酸（PolyM）、聚古罗糖醛酸（PolyG）及M和G随机组合形成的杂聚物（PolyMG）。褐藻胶裂解酶广泛存在于生长在海水、土壤和海洋藻类的微生物中，以弧菌、假单胞菌、固氮菌、芽孢杆菌、黄杆菌等海洋细菌最为常见，在少数真菌和病毒中也有褐藻胶裂解酶的存在。

褐藻胶裂解酶是一种专性裂解褐藻胶的多糖降解酶，可通过β消除反应切断酸性褐藻胶多糖糖苷键，并在新生成的非还原端C4，5 间产生具有不饱和双键结构的寡糖产物。褐藻胶裂解酶按其对底物降解方式的不同分为多聚α－L－1，4－古罗糖醛酸裂解酶、多聚β－D－1，4－甘露糖醛酸裂解酶及两种片段都能裂解的双功能裂解酶。褐藻胶的降解产物褐藻寡糖在医药、农业、食品等领域都具有巨大的利用潜力，有研究表明其在抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、抗真菌、神经保护、肠道消化吸收及植物的生长及保鲜等方面表现出良好的生物活性。

毕赤酵母表达系统具有细胞外蛋白分泌能力强、分离方便、无内毒素生成等优点。该系统通常是工业生产重组蛋白的首选，但目前还没有褐藻胶裂解酶在毕赤酵母系统中重组表达的报道。对毕赤酵母在褐藻胶裂解酶生产中的潜在应用进行研究具有很好的研究价值。

2018年，杭州师范大学的Haifeng Li等人在《Marine Drugs》（IF2018＝4．379，医学2区）发表了题为“High－Level Expression of a Thermally Stable Alginate Lyase Using Pichia pastoris， Characterization and Application in Producing Brown Alginate Oligosaccharide”的文章。在本研究中，对黄杆菌H63的褐藻酸裂解酶基因sagl在毕赤酵母中成功进行了表达，并获得了较高的产量。在此之前，由于包涵体问题，sagl基因在大肠杆菌中并没有得到很好的表达。同时，该研究对酵母生产的重组海藻酸裂解酶的特性进行了详细的研究。此外，利用该重组酶对褐藻酸寡糖的大规模生产进行了研究。

所用到的主要方法

METHODS

1．大肠杆菌和毕赤酵母重组表达；

2．SDS－PAGE；

3．Western blot；

4．去糖基化；

5．TLC薄层色谱；

6．ESI－MS；

7．氨基酸系统发育树构建与分析

文章主要内容摘要

ABSTRACT

本文将来源于黄曲霉H63的褐藻胶裂解酶基因sagl在密码子优化后在毕赤酵母中通过高密度发酵实现高表达，在酵母培养上清中sagl（rSAGL）重组酶的最高产量达到226．4 μg／mL（915．5 U／mL）。这是迄今为止海藻酸钠裂解酶重组表达的最高产量。rSAGL通过EndoH消化证实为部分糖基化蛋白。该酶的最佳反应温度为45°C、最适pH为7．5；在80 mM K＋浓度下最多可使酶的催化活性提高244％。rSAGL是一种热稳定酶，T5015为57～58°C，T5030为53～54°C，其热稳定性优于任何已知的海藻酸钠裂解酶。在pH为6的100 mM磷酸盐缓冲液中，rSAGL在50°C孵育2h后可保留98．8％的初始活性，在同样温度48 h后仍可保留初始活性的61．6％。通过毕赤酵母生产纯化后的rSAGL的特异活性可达到4044 U／mg，这是迄今为止海藻酸钠裂解酶的第二高记录。当rSAGL粗酶直接用于转化40 g／L的海藻酸钠，在50℃培养32小时后，可以将97．2％的底物转化成二、三、四糖。混合物中还原糖的最终浓度达到9．51 g／L。这是首次利用毕赤酵母系统高表达热稳定的褐藻胶裂解酶。