自噬诱导KDR/VEGFR-2激活,促进胶质瘤干细胞血管生成拟态形成
文章背景简介
血管生成是胶质母细胞瘤(GBM)的重要特征,与胶质母细胞瘤恶性程度密切相关。因此,目前几种治疗GBM的方法主要针对肿瘤内血管内皮细胞(ECs)的增殖。然而,贝伐单抗(BEV)的抗血管生成单一疗法未能提高患者的总体生存率,因为一旦治疗终止,耐药性和血管生成反弹就会迅速发生。与临床证据一致的是,动物模型中的抗血管生成治疗也发现会产生意外的恶性肿瘤发展,暗示在肿瘤血管生成过程可能存在绕过血管内皮细胞介导血管生成的逃逸机制。最近的研究表明,血管生成拟态(VM,是肿瘤细胞形成的另一种脉管系统)在GBM的进展中起着关键作用,而在肿瘤中靶向ECs可能不足以通过阻断肿瘤的血液供应抑制肿瘤的进展。
VM与肿瘤的新生血管形成有关。GBM的VM壁由表达GFAP、CDH5/cadherin 5、LAMB2/laminin B2和KDR/VEGFR-2的肿瘤细胞组成,提示其起源于胶质瘤干细胞(GSCs)。KDR是以同源二聚体形式存在的单螺旋跨膜受体酪氨酸激酶,由胞内区和胞外区组成。配体VEGF通过与KDR的胞外区结合来激活KDR。GSC衍生的肿瘤细胞形成VM,涉及KDR磷酸化和激活。然而,BEV未能减少GSCs在体外对KDR依赖性血管生成的影响,表明KDR介导的VM形成不需要KDR配体VEGF。因此,形成VM的GSC表达的KDR可能被VEGF以外的因素激活。
自噬作为一种溶酶体介导的过程,在肿瘤的发展过程中起着复杂的作用,当缺氧、营养和生长因子缺乏时,肿瘤细胞通过自噬降解错误折叠的蛋白质和受损的细胞器来维持生存。自噬可能在诱导肿瘤VM形成的条件下发生。例如,VM更常出现在肿瘤血管化不良的区域,肿瘤细胞在那里形成自噬体以维持生存。此外,自噬和VM基因调控的细胞过程不仅重塑而且适应肿瘤微环境的变化。值得注意的是,形成VM的恶性黑色素瘤细胞表达高水平的MAP1LC3/LC3(微管相关蛋白1轻链3),提示与这VM的形成有关。
第三军医大学Hai-Bo Wua 等人,于2017年在《Autophagy》杂志上(IF= 11.059,1区)发表了题为“Autophagy-induced KDR/VEGFR-2 activation promotes the formation of vasculogenic mimicry by glioma stem cells”的文章,文章主要建立了三维(3D)胶原支架培养模型,以研究自噬在GSCs调节VM形成中的作用。发现自噬通过ROS介导的肿瘤细胞中KDR的激活促进了GSCs 形成VM,而不依赖于肿瘤细胞衍生的VEGF。
所用到的主要方法
1、慢病毒转染及稳转细胞系构建
2、癌细胞异种移植
3、建立GMB小鼠模型
4、小鼠活体生物荧光成像技术
5、蛋白质印迹分析
6、实时荧光定量PCR(Q-PCR/Real-time PCR)
7、流式细胞荧光分选技术
8、细胞免疫荧光标记法(immunofluorescence)
9、免疫组化
文章主要内容摘要
贝伐单抗(BEV)是一种抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体,具有抗血管生成作用,已被用于抑制血管再生进而抑制恶性神经胶质瘤的生长。 然而,由于抗血管生成治疗的潜在抵抗机制尚不明确,这些益处只是暂时的。胶质瘤干细胞(GSC)能够形成血管生成拟态(VM),这是一种独立于VEGF驱动的血管生成的微血管循环。在本文中,作者发现BEV诱导的自噬促进了GSCs中VM的形成,这与肿瘤对抗血管生成疗法的抗性有关。本文建立了一个三维胶原支架来检测VM的形成和GSCs的自噬,发现雷帕霉素增加了VM的数量并增强了KDR/VEGFR-2的磷酸化。用氯喹处理或敲低自噬基因ATG5可抑制GSC中VM和KDR磷酸化的形成。值得注意的是,用BEV抵消GSCs产生的VEGF,不能重现氯喹治疗和ATG5敲低的效果,这表明自噬促进的VM形成与肿瘤细胞衍生的VEGF无关。当在GSC中诱导自噬并通过磷酸肌醇3-激酶(PI3K)-AKT途径激活KDR磷酸化时,ROS升高。ROS抑制剂Nacetylcysteine抑制了GSC的KDR磷酸化和VM的形成。然后,通过检查95例胶质母细胞瘤患者的标本,作者发现ATG5和p-KDR表达与肿瘤中VM的密度和不良的临床预后密切相关。因此,本文研究结果表明,自噬在胶质母细胞瘤(GBM)形成血管生成拟态(VM)的过程中起着至关重要的作用,可作为耐药性胶质瘤的治疗靶点。
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