传统的组织病理学处理组织包括固定、包埋、切片和染色等过程，会导致所得图像变形伪影且某些生物信息缺失，这对于医生对图像的观察和解释都会造成影响，并且这个过程会耗费大量的时间。

对于非线性光学显微镜，通过不同的激发光能实现不同的非线性成像过程，不同的非线性成像过程是由生物样品中不同的内源性生物分子引起的，这就说明不同的激发光能够“人工”的标记各种内源性生物分子，而不需要外源性染色剂或其他荧光剂进行“物理”标记，并且这些非线性成像过程都可以在实现CARS的多模态系统中实现。

图1中的三个系统都是比较常见的CARS显微镜系统，这些系统存在两个问题：第一，图中固体激光器直接出射的激光（“红色”光束）打到显微镜系统里，激光器的光束指向随时间和温度可能会漂移，指向不稳定性容易受到日常变化的影响，直接影响显微镜系统的成像，所以需要经常对进入显微镜的光束进行重新对准。

图1c中激光器出射的光束通过分束器分为两路，下面那路通过光子晶体光纤产生超连续谱（“绿色”光束），此时激光源的光束漂移只会影响到激光束与光子晶体光纤的耦合，进而影响从光纤中出射的超连续谱的能量，而不会直接影响后面的显微镜系统，但分束后上路的“红色”光束仍存在上面描述的问题。第二，实现CARS的多模态系统如何选择光源是一个需要考虑的问题，多模态系统通常需要飞秒脉冲来激发多光子荧光、谐波生成等过程，但是飞秒脉冲光谱较宽，用于CARS成像时远大于大多数分子振动特征峰的尺度（10cm－1）， 使得CARS的光谱分辨率较低，所以CARS显微镜一般使用皮秒激光器作为光源来获得较高的光谱分辨率。

图1 常见的CARS显微镜系统

2016年，Haohua Tu等人提出的无标记的多模态非线性成像系统比较好的解决了上面的两个问题，具体光路图如图2，光源为Yb： KYW激光器（1，041 nm， 220 fs， 80 MHz），使用一种保偏的全正色散的光子晶体光纤产生宽带单模超连续谱（780－1320 nm），光子晶体光纤放到激光器的后面、分束器的前面，这样就能保证分束后的两条光路都不会由于激光源的光束漂移而导致这两条光路的光束指向不稳定，进而影响后面的显微镜系统。

激光源的光束漂移只会影响到激光束与光子晶体光纤的耦合，为了减小这种影响，又使用反馈控制回路将光子晶体光纤的输出（输入）耦合功率保持在480 mW （800 mW）。接着通过离轴抛物面镜对输出的超连续谱进行准直，又通过二向色镜将光束分离为CARS泵浦光束（780－880 nm）和CARS斯托克斯光束（900－1，320 nm）。斯托克斯光束进入商用脉冲整形器中，不仅用于CARS成像，还用于2PAF，SHG，3PAF和THG成像。然后，两路光束通过另一个二向色镜合束，并通过消色差物镜（NA ＝ 1．20）聚焦，消色差物镜能够实现衍射极限成像。

其中，脉冲整形器可以用于对脉冲振幅整形，进行频谱选择，让不同波长的光通过，激发不同的非线性成像。还可以进行相位整形，用来补偿相位，获得变换极限脉冲，来激发SHG／THG／3PEF／2PEF；另外，斯托克斯脉冲通过脉冲整形器还能引入啁啾，通过电动装置调节啁啾后的斯托克斯脉冲与泵浦脉冲之间的光学延迟，实现“光谱聚焦”，这种“光谱聚焦”的方式可以提高飞秒CARS的光谱分辨率，最后得到的该系统的光谱分辨率为14 cm－1。

并且使用者能对整形器的振幅－相位掩模进行预编程，这样激光脉冲通过脉冲整形器后就会发生不同的改变，对应不同的非线性成像过程也就是激发不同的内源性物质。换一种说法就是激光在进行激发时作为可编程的变量，用脉冲整形器实现对激光的预编程，编程好的不同激光可用来激发不同的内源性物质（表1）。通过编程进一步将脉冲整形器变化脉冲与切换检测通道相匹配，就能做到激发和检测的匹配。

这样，未经过激光和显微镜培训的操作员在使用该成像系统时，能够有选择地在计算机屏幕上查看特定的内源性物质，通过按下预编程的按钮可以立即（可以远程进行）将当前成像物质更改为其他物质，激发和检测过程无需进行组织染色和激光的重新对准。

图2 无标记的多模态非线性成像系统

表1 预编程的激发／检测参

该组使用该系统对大鼠的乳腺肿瘤进行了成像，在不同的非线性图像及它们的复合图像中（图3、图4）观察到了正常细胞和肿瘤细胞的区别以及乳腺肿瘤生成的多个特征，与传统组织病理学作比较，发现大部分特征在传统组织病理学的图像中都观察不到，这也证明了无标记的多模态非线性成像系统的优势。

图3 乳腺标本的非线性多模态图像及其相应的FFPE–H＆E组织学图像

图4 乳腺标本的三模态图像中显示出的局部肿瘤浸润的光学特征

总之，Haohua Tu等人提出的无标记的多模态非线性成像系统有多个优势，他们将光子晶体光纤放到了激光器的后面，避免了激光源的光束漂移直接影响到显微镜成像；使用“光谱聚焦”的方式提高了飞秒CARS的光谱分辨率；用脉冲整形器实现对激光的预编程，编程好的不同激光用来激发不同的内源性物质，通过编程进一步将脉冲整形器变化脉冲与切换检测通道相匹配，方便操作人员的使用。

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多光子显微镜成像技术之八：大视场多区域脑成像技术

参考文献

［1］ Tu， H．， Liu， Y．， Turchinovich， D． et al． Stain－free histopathology by programmable supercontinuum pulses． Nature Photon 10， 534–540 （2016）．