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题目：植入前胚胎发育的可变剪切特点

一、研究背景

植入前胚胎发育在胎儿发育中起着至关重要的作用，需要精确的时空控制基因表达，所以对于胚胎发育中基因表达的分析显得至关重要。随着近年来RNA测序技术的发展（特别是单细胞RNA测序），有关植入前胚胎发育的研究也不断取得突破。

可变剪切（AS）即一条未经剪接的RNA，含有的多种外显子被剪成的不同组合，可翻译出不同的蛋白质。已有的研究表明，可变剪切对细胞的生长发育起着关键作用。

二、分析思路

三、结果解读两细胞阶段是植入前胚胎发育中基因转录的关键阶段

正如研究背景中说到的，可变剪切在基因的表达过程中起着关键作用。首先探究了胚胎发育过程中转录的关键阶段，通过利用RNA－seq数据、STAR软件，获取了不同阶段表达的基因数目；同时，根据基因表达（FPKM），确定了植入前胚胎发育中差异表达的基因（图一）从图一的结果可以看到，两细胞阶段基因表达量最高，这提示两细胞阶段可能是转录的关键阶段。

图1：不同阶段基因的表达数目

为了鉴定在两细胞阶段特异性表达的基因，使用了模糊c－均值（FCM）方法对植入前胚胎发育的RNA－seq数据进行分析。将表达的基因分为8类，其中在第2类中鉴别出了1415个基因（这代表这些基因在两细胞阶段特异性表达，见图2）并对这些鉴别出的基因进行GO分析（分析结果见图3左图）

既往报道显示两细胞阶段是染色质开始构建拓扑关联域（TAD）的时刻，在第2类中发现了CTCF（CTCF被认为与拓扑关联域的构建有关），为下一步作了铺垫。（图3右图）

图2：基因表达的聚类

图3：GO分析以及CTCF的表达情况

植入前胚胎发育过程中可变剪接的动态变化

在得到关键阶段后，开始研究文章的主要话题：可变剪切。发现两细胞阶段和合子阶段的基因表达情况与RNA剪切密切相关（图4）

图4

为了说明剪切在胚胎发育过程中的具体作用，使用拼接百分比（PSI）来测量与剪接点对齐的读取比例，根据PSI将基因分为了损失和增益两组。热图（图5）显示了PSI在植入前胚胎发育中动态变化，表明可变剪切在植入前胚胎发育中广泛存在。此外，还发现两细胞阶段的可变剪切数目最多。

图5：不同阶段PSI的情况

两细胞阶段的可变剪切

在说明两细胞阶段是关键阶段且可变剪切在该阶段数目最多之后，开始进一步研究该阶段可变剪切的具体情况。使用Venn图鉴定了695个在两细胞阶段发生AS的基因，并利用STRING得到了PPI网络，该网络可分为9个模块。

图6：Venn图和PPI网络

在这些基因中，重点关注了 Smarcb1，因为该基因被报道与染色质重塑有关。外显子计数表明大多数AS发生在7－9、13－27和23－27外显子上，后者对应于SMARCB1 CDS的3＇端；而该基因的C末端结构域（CTD）中存在突变会导致人类细胞中主要基因调控和形态的改变，这反过来提示这些不同的亚型可能在染色质重塑的调节中起作用。（外显子计数结果见图7）此外，GO分析显示这些基因与DNA ／ RNA过程和细胞周期高度相关，提示他们可能与接下来的增殖分化有关。

图7：外显子计数和GO分析结果

植入前胚胎发育中可变剪切类型的差异

利用rMATs（一款对RNA－Seq数据进行差异可变剪切分析的软件），检测每个阶段可变剪切的类型，分为5类：跳过外显子（SE），替代5＇剪接位点（A5SS），替代3＇剪接位点（A3SS），互斥外显子（MXE）和保留内含子（RI），并发现SE和MXE类型在AS中占很大比例且这两种类型在两细胞阶段十分丰富（这也与前面所说的“两细胞阶段是可变剪切的重要阶段”印证）

图8：不同阶段可变剪切的类型

此外，AS基因在两细胞阶段和其他阶段的表达明显不同（图4c），也支持了之前的发现（图9）

图9：AS相关基因在不同阶段的表达

两细胞阶段可变剪切与TAD有关

据报道，TAD在两细胞阶段开始形成，染色质开始重塑。为了研究染色质组织的动态变化是否与AS相关，分析了Hi－C两细胞阶段的数据，在3628个基因中发现了691个位于TAD的AS相关基因，结果表明，TAD中发生了大量AS。以Smc4为例（图10左），其中蓝色代表A compartment，橙色代表B compartment；下面则是Smc4在合子期和两细胞阶段的表达情况。

为了确认AS在TAD中特异性富集，计算了绝缘分数（IS），更高的IS表明AS在TAD中特异性富集。然后在全基因组范围内分析了AS的发生频率，circos plot显示，AS在TAD中富集，但与A ／ B compartment无关（从外到内的圆圈依次代表A ／ B compartment，密度，TAD边界和IS得分）。

图10：Smc4（左）circos plot展示AS在全基因组的发生频率（右）

小结

首先证明，在植入前胚胎发育的阶段中，两细胞阶段具有更高数量的表达基因。在此基础上，确定了在两细胞阶段高表达的基因簇，并在该阶段检测可变剪切的类型，发现可变剪切在两细胞阶段发生频率较高。最后，发现AS与染色质结构有关且在TAD中尤为常见。所以，植入前胚胎发育的转录过程大致为：一些与染色质结构相关的基因的转录被启动，以促进两细胞期TAD的形成，然后这些TAD进一步促进其他细胞发育相关基因的转录－－构成一个自我调节的环路。