通过ESTIMATE算法计算免疫，间质和ESTIMATE得分，并以此筛选DEGs，进行生存分析、KEGG、GO、GSEA分析，构建PPI网络并筛选hub基因，最后通过构建风险评分（RS）模型，研究hub基因的预后价值并用验证集进行验证。

题目：从TCGA数据库中筛选对急性髓系白血病有预后价值的基因

一．研究背景

急性髓系白血病（AML）是一种造血克隆性恶性肿瘤。AML患者的治疗和预后取决于准确的细胞遗传学和基因检测。AML疾病状况的改善主要得益于支持疗法和造血细胞移植的进步。然而，由于高复发率，AML的5年生存率仍然很低，因此迫切需要新颖有效的治疗方法。从免疫治疗的角度出发，希望找到与AML的肿瘤微环境相关的具有预后价值的基因。

二．分析流程

三．结果解读

1．数据收集与处理

收集了TCGA中三级AML患者的转录组资料，即入选的样本在样本ID中以＂－03＂结尾，属于＂原发性血源癌－外周血＂。一共入选了173例样本。使用GDC工具提取样本的临床特征和生存数据，使用limma包进行归一化处理。

2． 免疫评分与癌症和急性白血病B组（CALGB）细胞遗传学风险类别和生存结果相关

使用ESTIMATE算法分别计算样本的免疫评分、基质评分和ESTIMATE评分。绘制箱线图，观察上述评分与CALGB细胞遗传学风险类别的关系。

免疫评分越高与CALGB细胞遗传学风险类别的风险等级越高相关（P＝0．0396，图1A）。

基质评分和ESTIMATE评分未观察到与CALGB细胞遗传学风险类别之间的显著性（分别为P ＝ 0．8585和P ＝ 0．3320，图1B，C）。

根据免疫评分、基质评分和ESTIMATE评分的中位数分别将AML样本分为高分组和低分组，绘制生存曲线，评估这三个评分与总体生存率之间的关系。

免疫评分和ESTIMATE评分越高，总体生存情况越差（分别为P＝0．0224，P＝0．0195，图1D，F）。

基质评分的不同水平与总体生存率之间无显著关系（P＝0．3676，图1E）。

图1 免疫评分、基质评分、ESTIMATE评分在CALGB细胞遗传学风险类别中的分布情况箱线图以及生存曲线

3．AML中基于免疫评分和基质评分的表达谱比较

将免疫评分和基质评分按中位数分为高组和低组，分别绘制基因表达热图（图2A，图3A）。并根据免疫评分和基质评分的高低组分别筛选DEGs（PFDR ＜ 0．05 ， ｜log2FC｜ ＞ 1），绘制火山图（图2B，图3B）。通过Venn图对两组获得的DEGs取交集。

在免疫评分组中筛选了331个上调的DEGs和889个下调的DEGs。

在基质评分组中筛选了195个上调的DEG和870个下调的DEGs。

在Venn图中，筛选出147个有交集的上调基因（图2C）和680个有交集的下调基因（图2D）。

图2 基于免疫评分分组的表达谱热图、火山图以及Venn图

图3 基于基质评分分组的表达谱热图、火山图

4．功能富集分析

对上一步得到的有交集的DEGs进行GO和KEGG富集分析。结果显示这些DEGs和免疫反应存在显著关联。

GO分析主要富集于炎症反应、免疫反应、细胞膜、受体活性。图4A，B，C分别展示了生物过程、细胞成分和分子功能的前10个条目。

在KEGG通路注释（图4D）和富集分析（图4E）中，主要是与免疫、癌症和结核病相关的通路。通路富集分析的前20条结果如图4F所示。

图4 GO和KEGG分析结果

5．PPI网络的构建以及hub基因筛选

使用STRING数据库构建了包含786个节点和1774条边的PPI网络。使用Cytoscape的cytoHubba插件来识别hub基因，从12种算法中选择了前10个节点，并排除了degree＜10的基因。最后，确定了18个TME相关的hub基因：ITGAL、ITGAM、HLA－DRB1、HLA－DRB5、FPR1、CX3CR1、TNFRSF1B、CXCL16、CTSB、CTSS、HLA－DRA、P2RY13、ITGB2、CEACAM3、SLC11A1、C5AR1、ADORA3和GNGT2。

图5 cytoHubba插件基于12种算法进行hub基因识别

6．GSEA分析

随后进行GSEA分析，并设置FDR＜0．25、｜enriched score｜＞ 0．35、基因集内基因数≥35。

GSEA的结果表明：抗原加工和呈递，B细胞受体信号传导通路，趋化因子信号传导通路，FcγR介导的吞噬作用，移植物与宿主疾病，造血细胞谱系，产生IgA的肠道免疫网络，NK细胞介导的细胞毒性，NOD样受体信号传导通路，T细胞受体信号传导通路和Toll样受体信号传导通路是肿瘤免疫相关交叉基因富集的主要通路（图6）。

图6 GSEA分析的结果

7．风险评分和生存分析

基于多变量Cox回归分析，计算出每个AML患者的风险评分（RS）公式。

RS ＝ ITGAL ＊ 0．177 ＋ ITGAM ＊ 0．315 ＋ HLA－DRB1 ＊ 0．371 ＋ HLA－DRB5 ＊ （?0．009） ＋ FPR1 ＊ 0．034 ＋ CX3CR1 ＊ （?0．074） ＋ TNFRSF1B ＊ 0．172 ＋ CXCL16 ＊ （?0．104） ＋ CTSB ＊ （?0．38） ＋ CTSS ＊ （?0．201） ＋ HLA－DRA ＊ （?0．353） ＋ P2RY13 ＊ 0．003 ＋ ITGB2 ＊ 0．038 ＋ CEACAM3 ＊ （?0．051） ＋ SLC11A1 ＊ （?0．034） ＋ C5AR1 ＊ （?0．049） ＋ ADORA3 ＊ 0．213 ＋ GNGT2 ＊ 0．208

随后根据中位数将163例AML患者分为低RS组和高RS组，进行生存分析，研究不同RS水平与总体生存率之间的关系。结果表明，高RS与不良的总生存期有关（图7A）。然后绘制ROC曲线，并计算曲线下面积AUC为0．725，显示出RS对总体生存率的预测准确性较高（图7B）。

图7 RS的预后价值

此外，还绘制了18个hub基因的生存曲线，以探讨预后价值（图8）。结果显示，hub基因的高表达水平与不良的总体生存率有关。

图8 18个hub基因的K－M曲线

8．Vizome数据库分析

Vizome是最大的AML数据库，它包含了从562名患者收集的672份肿瘤样本的全外显子组测序数据。验证了Vizome数据库中hub基因的表达水平。热图显示，18个hub基因在数据库中的样本中表现出高表达（图9A）。图9B中还显示了其中4个hub基因的相互作用关系。

图9 验证Vizome数据库中hub基因的表达水平

小结

       利用TCGA数据库，基于ESTIMATE算法得出的免疫评分和基质评分得到了可预测AML患者预后不良的TME相关基因，并对其进行对进行功能富集分析。构建PPI网络，筛选得到TME相关的hub基因，并构建RS模型，为预测AML患者的生存状况提供了新的依据。