前言

过继性免疫治疗是血液学的一种变革性治疗方法,它通过基因工程在T细胞表达合成嵌合抗原受体(CAR)。针对 B 细胞白血病和淋巴瘤中的 CD19 抗原的 CAR-T 细胞已得到临床认可,目前成为全球范围癌症中心实施的“常规” 治疗手段。

CAR结构由三部分组成:细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和含有CD3ζ或共刺激分子的细胞内信号转导结构域。CAR-T细胞具有诱导体液和细胞免疫抗CAR应答的潜力,这些免疫应答是针对CAR的非自身成分或源自基因转移载体的残余蛋白,这些蛋白具有固有的免疫原性。

这种免疫反应可能会限制CAR-T细胞得疗效。目前临床开发中的许多CAR的单链抗体来自小鼠或其他非人类抗体。虽然到目前为止,还没有确凿的证据表明这种抗CAR免疫反应会导致其他不良反应,如细胞因子释放综合征(CRS)和免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS),但是已有证据表明,CAR或载体残留蛋白特异性的T细胞会清除和灭活注入的CAR-T细胞。同样,体液免疫产生的CAR中和抗体也会促进CAR-T细胞的凋亡。

因此,随着CAR-T技术的进展,在提高疗效和持久性的同时,了解CAR-T细胞免疫原性的起源和机制仍非常关键,尤其是在实体瘤患者。

抗CAR免疫的临床证据

在已获批上市的CAR-T产品中,Kymirah和Yescarta都观察到了已存在的体液免疫。在临床试验中,接受Kymirah的绝大多数B-ALL患者(84．6%,n=88)有预先存在的抗CAR抗体,在难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤的患者中比例高达91．4%。相比而言,在接受Yescarta治疗的患者中,预先存在的抗CAR抗体就少的多(3%,n=94)。但是总体而言,这些存在的抗CAR抗体的患者并没有表现出更差的临床结果,CD19靶向CAR的抗抗体似乎不会损害初始的临床反应。

然而与预先存在的抗体相比,输注后出现的CAR特异性细胞毒性T细胞可能与一些临床试验的治疗失败有关。在第一代自体CD19 CAR-T细胞的剂量递增试验中,首次报道了这种细胞免疫情况。两名患者在第一次输注(108个细胞/m2)24小时后虽然都检测到了CAR-T细胞,但它们无法持续存在,甚至不到1周。尽管以更高剂量再输注并使用IL-2支持,CAR-T细胞在体内仍不能存活。这种失败可能在一定程度上是制造方法的原因,但在第一次输注前存在的T细胞介导的抗CAR反应可能会加剧这种结果。

尽管一些血液系统恶性肿瘤患者在首次输注CD19 CAR-T细胞的完全缓解率很高,但疾病复发仍然是一个问题,大约30-50%的患者在12个月内复发。对于这些复发的患者,重复输注是一种很有吸引力的选择。然而,第二次或随后输注的临床反应一般都不理想,通常只有<25%的患者出现完全缓解。随后的患者的亚组分析中,观察到了CAR特异性的细胞毒性T细胞的扩增,这种细胞与重复输注后CAR-T细胞的扩增减少有关。

此外,针对除CD19外的其它靶点的CAR-T细胞和新一代的CAR-T细胞,都发现了存在针对CAR-T细胞的体液和细胞免疫,可能与不良的临床结果相关。

降低固有的CAR免疫原性

CAR结构的几个组成部分有可能触发患者的抗CAR免疫反应。可以使用各种方法降低这些成分的免疫原性。

人源化肿瘤反应性单链抗体

一些研究人员正在开发和测试人源化单链抗体,以规避与小鼠源性单链抗体相关的抗CAR反应。人源化后的免疫原性可能较低,并且对于初次输注小鼠来源的CAR-T细胞后疾病复发的患者或未经CAR-T细胞治疗的患者是一种不错的选择。

另一种策略是用缺乏轻链和潜在免疫原性连接序列的重链抗体。2019年11月报告了BCMA特异性全人重链抗体CAR-T的首个临床结果。然而从理论上讲,全人源抗体仍然可以在患者中引发涉及抗独特型抗体的免疫反应,因此,直接比较小鼠源性和人源化单链抗体免疫原性的头对头临床试验是有必要的。

肿瘤特异性结构域

除了基于单链抗体的CARs,肿瘤细胞也可以通过内源性肿瘤特异性受体-配体相互作用作为靶点。CAR的scFv部分可以被受体的胞外区或与受体结合的配体所取代。目前正在进行临床前和早期临床评估的这种CAR结构包括嵌合NKG2D受体,IL-13、整合素αvβ6结合肽和heregulin-ζ chimaeras。然而,到目前为止,还没有关于使用这种通用受体策略的免疫原性数据。

CAR间隔区突变

scFv与靶抗原表位的最佳结合对于有效的CAR-T细胞治疗至关重要,尤其是靠近肿瘤细胞膜的近端表位可能需要具有更长和更灵活铰链结构域的CAR-T细胞。许多研究小组使用了各种IgG重链的恒定区作为间隔,然而重链恒定区的CH2和CH3结构域可被固有免疫细胞(如巨噬细胞、粒细胞和NK细胞)上的Fc受体靶向,并可能造成免疫原性风险。这种情况可以通过突变间隔区内的Fc受体结合表位来避免,从而阻止先天免疫细胞活化。

新型CAR技术的免疫原性

细胞因子

CAR添加细胞因子旨在提高CAR-T细胞的抗肿瘤效果,特别是为了克服免疫抑制微环境,如IL-15。然而,细胞因子的应用,可能增加患者免疫原反应的风险,并可引起诸如发热、寒战、低血压、血小板减少和淋巴细胞减少等毒性反应。

旁观者T细胞活化是这种旁分泌细胞因子支持策略固有的理论风险,尽管旁分泌细胞因子是否能放大任何抗CAR反应仍有待进一步研究。相应地,通过改造CAR-T细胞的细胞因子受体或受体胞内信号结构域可仅向CAR-T细胞提供免疫调节细胞因子信号,而不影响旁观者淋巴细胞,这种策略目前正在临床试验中进行研究(NCT035332和NCT0499997)。

自杀基因与清除标记

尽管对某些血液恶性肿瘤患者有效,但由于靶向非肿瘤毒性以及附加技术带来的不可预测的不良影响,使CAR-T细胞治疗面临着很多安全风险。

在CAR-T细胞中加入自杀基因和清除标记是一种减少严重不良事件的有效手段,可以控制CAR-T细胞的定向清除。然而,这种方法也存在着免疫原性反应的风险。例如,在表达HSV-TK作为自杀基因的T细胞中鉴定出多个免疫原表位,从而导致CD4+T细胞和CD8+T细胞介导的抗CAR-T细胞反应。

由人类来源的蛋白(如截短的EGFR或iCaspase 9自杀系统)改造的清除标记同样也可能增加免疫原性的风险。为在CAR-T细胞产品中实现安全基因,许多研究人员选择将2A序列与CAR共表达,最近,包括基因编辑也被用来创建无转基因的自杀开关,这些方法相关免疫原性的风险都需要进一步的研究。

基因编辑

基因编辑增强CAR-T细胞的功能是目前热门的研究领域,如通过基因敲除破坏内源性免疫检查点蛋白的表达,从而提高CAR-T细胞的性能。此外,基因编辑也可用于通过消除细胞表面MHC的表达来逃避T细胞介导的抗CAR免疫,用于同种异体CAR-T细胞。

基因编辑除了要避免脱靶效应意外,由CRISPR–Cas9系统引起的免疫原性相关风险,也可能导致T细胞介导的Cas9表达细胞的清除。然而,临床研究显示,瞬时CRISPR–Cas9递送系统并未影响异源TCR重定向T细胞的持久存在。因此,与组成性过度表达相反,瞬时表达可能是CAR-T细胞基因编辑的首选方法,值得进一步研究。

异基因CAR-T细胞的免疫原性

使用健康捐赠者的细胞制作现成的同种异体CAR-T细胞是一种非常有吸引力的方法,可能扩大这些细胞的临床适用性,确保及时可用性。然而,在这些CAR-T细胞上表达的非自身MHCs可能引起宿主源性的免疫反应,导致免疫介导的细胞清除。

异基因CAR-T细胞可被患者的对外来主要MHC抗原具有特异反应性的T细胞靶向。即使是部分HLA匹配的供体,也可能由于多态性引起的微小抗原差异产生额外的免疫原性。

有几种方法被用来产生MHC抗原表达减少的CAR-T细胞,从而使患者的治疗不受HLA差异的影响。

通过直接编辑HLA位点或破坏B2M基因编码,有可能阻止CD8+T细胞的同种异体排斥反应。然而,由于T细胞活化引起MHCⅡ的上调,同种特异性CD4+T细胞介导的CAR-T细胞排斥反应也可能发生。通过敲除MHCⅡ基因的主要转录因子CIITA来消除MHCⅡ的表达,可以减轻这种排斥。

这些方法对T细胞介导的排斥反应有一定的抑制作用,然而,矛盾的是,HLA分子的丢失使得异基因CAR-T细胞也容易被NK细胞杀伤。因此,人们开发出NK细胞抑制转基因来促进转基因细胞在免疫活性宿主中的持久性。例如,Gornalusse等人通过在人类多能干细胞中表达融合到B2M和诱饵抗原的非多态性HLA-E分子,开发出对CD8+T细胞和NK细胞的排斥具有抵抗力的细胞。其他策略还包括多重基因编辑、CD47过表达以及一种“同种免疫防御受体”的方法。

此外,广泛的淋巴耗竭也可以降低立即发生同种异体排斥的风险。但是,这种方法可能由于持续的同种异体CAR-T细胞增殖而导致移植物抗宿主病(GvHD)的可能性。为了降低GvHD的风险,研究人员选择将CAR转移到病毒特异性T细胞中,从而产生更安全的产品,因为此类细胞的TCR不太可能具有同种异体反应。

小结

CAR-T细胞是目前治疗某些复发和/或难治性恶性血液病的重要手段。然而,CAR-T细胞具有免疫原性,可能影响CAR-T细胞治疗的效果。虽然在血液瘤中,通过清除内源性B细胞可以降低对CAR-T细胞免疫应答的风险,然而,针对非B细胞恶性肿瘤(如实体瘤)的CAR-T细胞可诱导T细胞和B细胞反应,从而增加免疫原性的风险。

此外,开发提高CAR-T细胞安全性和/或功能性的技术,如自杀基因或细胞因子,也可能带来新的免疫原性风险,异基因供体来源的CAR-T细胞的出现和发展同样引起了人们对免疫原性问题的关注。

现有的策略,通过替换人源化单链抗体或其他免疫原性较弱成分的CAR可能降低抗CAR免疫的风险,在临床上,加强淋巴耗竭对于减轻抗CAR免疫反应和促进CAR-T细胞的持久性仍然至关重要。

因此,有必要在临床前和临床研究中纳入CAR相关免疫原性分析,以便对免疫原性反应及其影响进行详细研究,以确保CAR-T细胞在癌症患者治疗中的安全性和有效性。这些信息也会增加我们对免疫原性临床相关性的理解,并为未来CAR-T细胞策略的发展提供帮助。