传统上一般用长波紫外线照射核黄素诱导角膜基质的交联和固化,来治疗圆锥角膜和LASIK术后扩张导致的发展性严重散光。这种胶原交联能够增强蓝色胶原自发荧光,并增强角膜的机械硬度,研究表明UVA交联技术可以阻止或逆转一些角膜病变。

UVA交联有如下缺点:

(1)UVA照射和氧自由基的产生具有细胞毒性,角膜厚度不足400 μm的患者不能接受标准治疗。

(2)交联操作不够精确,交联的横向位置很难控制。

(3)单光子激发时,基质及核黄素对UVA的吸收降低角膜深处的交联效率。

(4)长时间的核黄素激发也会导致光漂白以及核黄素激发和胶原交联反应的丧失。

使用近红外光进行核黄素的双光子激发可以很好地规避这些缺点。第一篇文章中的装置图如图1所示。波长为760nm的飞秒激光经由一个可变扩束器,从而调节系统的有效NA并控制焦体积的大小。之后经由xy扫描镜后再通过第二个固定光束展宽器在光束到达物镜的后孔径之前再次扩束。深度扫描是由物镜上电脑控制的马达驱动实现。在操作过程中,可拆卸的角膜接触镜锥用来维持角膜平坦、稳定眼睛并确定零平面。

图1 可变数值孔径的多光子光学交联系统

实验中,离体活性兔眼球浸泡在核黄素溶液中,角膜中心处4mm的区域经由不同参数下的激光激发。扩束器设置对于焦体积大小和轴向长度都有很大影响:扩束器能产生大于7．5倍的焦体积变化以及2．5倍轴向长度的减少。焦体积的整体轴向变化可以从0平面向下400μm。

光致交联的程度可以由角膜胶原蛋白的荧光来表征,还可以使用探针压痕法检测光交联对角膜的强化作用。与对照组比较,紫外光角膜交联及非线性角膜交联的机械硬度都有大幅提高。如图2所示,与紫外光核黄素交联相比,非线性角膜交联的自发胶原荧光强度没有很大差异,可以认为两种交联技术都能产生很好的屈光矫正效果。

图2 NLO-CXL,UVA-CXL及对照组的实验结果对此

第一篇文章中使用的76 MHz fs激光器的单脉冲能量为11．8 nJ,平均功率为900 mW,不符合ANSI 46．1 mW的角膜安全限制。在第二篇文章中,该课题组对系统进行了改进,使用1030nm种子源,经非线性光参量放大器转换为波长为760nm的飞秒脉冲,其重复频率在50-150kHz,实验装置如图3。

图3 改进后的实验装置

实验中,在离体及活体兔角膜上的非线性角膜交联术都获得了接近紫外光角膜交联术的效果。临床中发现手术48小时后的角膜没有发红肿胀和起雾(图4A),图4B、4C是2周后体内共聚焦显微镜横截面及深度在178微米处的平面图象,说明在治疗区域内有细胞迁移。同时短期组成像还发现治疗组眼上皮明显增厚,基质厚度不变,雾度有所增加。图4D为两周后胶原自发荧光测量结果,为一个皮下90微米处,连续的110微米厚的自发荧光带。图4E为染色后横截面示意图,发现治疗区域都出现了角膜基质细胞,与UVA治疗的样品有差异。

图4 改进后系统的实验结果

总之这两篇文章验证了在合适的参数下,非线性角膜交联术可以产生与紫外角膜交联术相媲的角膜交联效果,可以增强角膜强度,进行屈光矫正。兔角膜活体实验也表明非线性角膜交联术具有潜在的临床应用价值,可用于进行个性化交联来治疗屈光不正和圆锥形角膜。

参考文献:

[1] Bradford S M, Mikula E R, Chai D, et al． Custom built nonlinear optical crosslinking (NLO CXL) device capable of producing mechanical stiffening in ex vivo rabbit corneas[J]． Biomedical optics express, 2017, 8(10): 4788-4797．

[2] Bradford S, Mikula E, Kim S W, et al． Nonlinear optical corneal crosslinking, mechanical stiffening, and corneal flattening using amplified femtosecond pulses[J]． Translational vision science & technology, 2019, 8(6): 35-35．