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  文章背景简介  

BACKGROUND INTRODUCTION

PIK3CA（phosphoinositide－3－kinase，催化α多肽）基因突变是人类癌症中最常发生突变的基因之一，已在乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌等中发现。此外，PIK3CA突变与癌症患者的较差生存率有关。在PIK3CA突变中，PIK3CA H1047R基因突变与癌症的早期诊断、个体化治疗和预后相关。因此，检测具有高特异性和敏感性的PIK3CA H1047R基因突变在癌症筛查中具有重要意义。

通常，检测 PIK3CA 基因突变的常规方法包括DNA测序和基于 PCR 的方法。然而，临床上可用的 DNA 测序只能在野生型 DNA的情况下检测到0．1％～1％的突变DNA，这对其在临床实验室的广泛应用提出了挑战。例如，为了提高突变检测的灵敏度，宋氏课题组提出肽核酸（PNA）介导的PCR特异性鉴别PIK3CA基因突变，灵敏度为0．2％。随后，丁氏课题组采用等温以同等灵敏度分析相同突变的扩增策略。然而，这些方法实际上仍然难以检测同质样品中的少量突变等位基因。在这种情况下，临床诊断中的突变分析需要更高特异性和敏感性的策略。

近年来，针对突变位点的高保真识别提出了多种经典策略，如表面连接反应、错配结合蛋白介导策略、基于分子信标的方法等。事实上，这些策略可以特异性地检测突变区域以避免复杂的DNA测序，并由于其出色的突变识别能力而广泛扩展了基因诊断中的突变检测。但是，这些方法存在一些固有的缺点，例如特异性差和灵敏度低。

作为识别基因突变的替代生物分子，NsbI限制酶作为位点特异性限制酶可以识别特定位点（5＇－TGA GCA） 并切割双链 DNA。目前，NsbI限制性内切酶在电化学生物传感中用于PIK3CA基因突变检测的应用尚未见报道。此外，链置换扩增（SDA）反应作为靶点循环扩增的有效方法而广为人知，通过该反应可以有效地获得DNA拷贝并放大生物信号。

另一方面，各种基于生物传感的方法，如荧光、比色和电化学方法，已被用于检测基因突变。在这些方法中，电化学策略因其灵敏度高、成本低、反应快等优点而在基因诊断领域受到越来越多的关注。新兴的纳米器件已被引入电化学平台以进一步提高灵敏度，包括金属纳米颗粒、金属有机框架 （MOF） 和独特的 DNA纳米结构。到目前为止，由于具有放大电化学信号的能力，许多独特的 DNA 纳米结构已被应用于生物传感器的设计。例如，Chen 和他的同事开发了一种超灵敏的电化学 DNA 生物传感器，使用远程自组装 DNA 纳米结构作为信号放大的载体。此外，朱的团队通过基于发夹组装的生物传感器检测人类端粒酶RNA，将灵敏度提高到 17．0 fM。作为一类新型 DNA 纳米结构，通过简单制造工艺的四通 DNA 连接被选为开发电化学生物传感器的候选材料，通过这种方法可以捕获更多的电活性分子，从而显着增加电化学信号并提高生物传感器的灵敏度。

生物传感技术已被开发用于基因突变，以满足对良好重现性、短时间消耗和高灵敏度的持续要求。受上述启发，通过将 NsbI－SDA 反应与基于发夹的四向 DNA 连接相结合，研究人员开发了一种电化学生物传感器，可以超灵敏地检测 PIK3CA H1047R基因突变。通过这种策略，NsbI－SDA 不仅可以特异性区分 PIK3CA H1047R基因突变，还可以显著增加DNA拷贝数，而新型四向 DNA 连接可以捕获大量电活性亚甲蓝（MB） 以增强电化学响应。更重要的是，这种电化学生物传感器可以检测生物样品中的低丰度基因突变，在基础研究和临床诊断方面都有潜在的应用前景。

2020年，重庆医科大学Tong Wang等在《Biosensors and Bioelectronics》（生物工程与应用微生物1区 IF＝11．213）发表了名为“An integrated electrochemical biosensor based on target－triggered strand displacement amplification and“four－way” DNA junction towards ultrasensitive detection of PIK3CA gene mutation”的研究论文。

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所用到的主要方法

METHODS  

1． 实验将 NsbI 限制性内切酶与 SDA 相结合，设计了一种新的均相反应策略，通过该策略识别 PIK3CA H1047R基因的突变位点并改善生物信号。

2．实验通过简单直接的自组装过程制造了一种新型的四向 DNA 连接，以捕获大量的电活性亚甲蓝 （MB） 以增强电化学响应。

3．实验基于 NsbI 限制性内切酶介导的链置换扩增 （NsbI－SDA） 和基于发夹的四向 DNA 连接的新型电化学传感器可检测低至0．001％的PIK3CA H1047R基因突变。

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文章主要内容摘要

ABSTRACT

首次基于NsbI限制酶介导的链置换扩增（NsbI－SDA）和四向DNA连接构建了一种新型电化学生物传感器，用于特异性和超灵敏检测PIK3CA H1047R基因突变。在该生物传感器中，NsbI限制性内切酶结合链置换扩增 （SDA） 能够特异性区分 PIK3CA H1047R 基因突变和增加 DNA 拷贝数以改善电化学反应。在目标突变基因存在的情况下，由NsbI限制性内切酶切割产生的DNA片段可以触发SDA反应，产生大量的连接链。当连接器链被捕获在电极上时，四向DNA接头随后连接到连接器链的末端。通过将亚甲蓝（MB）的电活性分子整合到四向 DNA 连接中，这种三明治状电化学生物传感器能够以0．001％的低检出限确定目标突变基因的特异性区别。最后，该策略可用于分析掺入人血清样本中的突变基因，最后，表明该方法在遗传分析和临床疾病诊断中具有潜在的应用价值。

       原文标题 : 生物传感器对PIK3CA基因突变的超灵敏检测