01

背景介绍

核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic Acid），存在于生物细胞（主要分布在细胞质中）以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。

02

实验流程

一、细胞RNA的提取

研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT－PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

实验所需试剂和材料：Trizol（4℃保存）、无水乙醇、氯仿（三氯甲烷）、DEPC水、异丙醇（－20℃预冷备用）、移液枪枪头（RNase－free）、 EP管（RNase－free）。

实验操作流程：

1．样品准备：将细胞接种于6孔板中，经干扰和加药处理后，吸弃培养基，每孔加1mL处理细胞用PBS漂洗细胞两次。每孔加1 mL TRIzol Regent，4℃；

2．裂解20 min 裂解细胞。之后用移液器轻轻吹打，使裂解物均匀，并用移液器转移至 RNase－free的1．5 mL离心管中，可放于－80℃保存；

3．超净台台面，实验所需材料用75％酒精擦拭并紫外照射30min灭菌。通风10min后进行实验；

4．冰上完全溶解样品，向每管裂解物中加入200 μL氯仿，盖好管盖，上下轻轻颠倒混匀20s，冰浴 5 min；

5．混合物置于 4℃，12000 r／min离心15 min；吸弃上清，置于超净台中室温放置15 min；

6．离心后，样品分为三层，上层水相为RNA，中层沉淀为蛋白质和DNA，下层为多糖等。小心吸出上层水相400μL（400μL就够了，建议切勿贪多），转移到新的EP管中；

7．每1 mL裂解物加400 μL预冷的异丙醇，轻柔颠倒混匀15 s后置于－20℃、1 h沉降RNA；

8．－20℃沉降 1 h 后，沉降体系于4℃，12000 r／min 离心10 min。后打开离心管盖，将离心管放平，小心倾倒其中液体，保留沉淀；

9．每管1 mL 预冷的 75％乙醇溶液，盖好管盖，用力震荡离心管悬浮沉淀，漂洗沉淀。后于 4℃ 13000 r／min 离心 10 min，吸弃上清，保留沉淀；

10．吸弃上清的离心管倒置于超净工作台中，风干10 min；

11．每管加入适量DEPC处理水，溶解RNA沉淀；

12．利用超微量核酸定量仪测定RNA浓度。

注意事项：RNA易分解，实验在超净工作台进行是不需要点燃酒精灯，需避火操作。RNase酶是导致RNA降解的最主要的物质，可以水解RNA的磷酸二酯键，广泛存在于人的皮肤上，因此，在RNA制备有关的分子学实验时，必须戴手套，并且RNA提取实验中所使用的移液器和EP管需是RNase－free物品。由于DEPC的剧毒性，实验室是现在一般枪头与EP管高压灭菌3次以上。DEPC水现可由市面上的无菌水／RNase－free水代替。

二、运用M－MLV逆转录酶将RNA逆转录成cDNA

利用Promega 公司生产的M－MLV逆转录酶将RNA逆转录成cDNA。反应体系为2 μg RNA，25 μL体系实验试剂：dNTP（4 ℃保存），M－MLV（－20 ℃保存），RNasin（－20 ℃保存）。

1．超净台中取EP管进行标注，按照图1，每管加入5 μL的随机引物，同时加入2 μg的RNA模板，混匀后置于70℃的恒温孵育器中5 min，使得随机引物与模板链孵育结合，然后迅速置于冰上进行冷却；

2．每管按照5 μL 10 M的dNTP、5 μL的5×Buffer、0．625 μL的RNase inhibitor? 以及1 μL的M－MLV逆转录酶（酶放置于冰盒中）配制成预混液，分装至每个EP管，用DEPC水补齐至终体积25 μL；

3．漩涡震荡混匀离心之后，置于37℃恒温孵育器中孵育1 h；

4．调节温度至70℃终止反应，10min，得到的cDNA至－20℃冰箱中保存备用。逆转录的过程中需操作迅速、谨防污染；需注意cDNA 不稳定，切勿反复冻融。

三、实时定量PCR

常规PCR中，扩增产物（扩增子）是通过终点法来分析检测，即 PCR 反应结束后，DNA 通过琼脂糖凝胶电泳，然后进行成像分析。而荧光定量 PCR 可以在反应进行过程中进行累积扩增产物的分析和检测，即“实时”。

在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应 DNA 量的增加，使 PCR 产物的实时检测成为可能。利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。RT－PCR技术可用于检测细胞和组织中基因表达水平，克隆特定基因 cDNA序列和检测RNA病毒。

（1）实时定量PCR具体操作：

按照图中体系在1．5 mL的EP管中配制反应预混物，漩涡震荡混匀之后，按照预先安排的顺序分装至八连管中。分装至八连管之后按照循序加模板，为保证数据的准确性，样品每组做3个平行，并根据引物的数量设置阴性对照。预混应体系配制过程中全程避光，配好以后置于掌式离心机离心数秒，使所有组分沉降于八连管底部。锡箔纸包住EP板，转移至Real time PCR反应仪器中，设置反应程序后，点“Start”启动反应。

（2）连机依次设置参数如下：

a、StepOne Instrument（48 wells）：根据仪器规格选择48孔／96孔；

b、Quantitation（相对定量）：选择相对定量的方式，目的基因与内参基因Ct数值；数值；

c、Comparative（△△Ct）：采用△△Ct法对数据进行处理；

d、SYBR Green：所选试剂中的荧光染料为SYBR Green；

e、cDNA：选用的模板为cDNA，进行特异性的扩增；

f、输入待测靶基因的数目同时输入相应靶基因名称；

g、输入待测样品的数量、设置平行性个数、靶基因的阴性对照及相应的待测样品的名称；

h、设置样品中的control组及阴性对照组；

i、实时PCR的反应条件如下表所示。

Stage 1

预变性

Stage 2

PCR反应

Stage 3

溶解曲线

95℃ 2 min

95℃ 10 s

60℃ 30 s

40个循环

95℃ 1 min

55℃ 1 min

95℃ 15 s

正确的实验技巧是成功的荧光定量 PCR 反应重要然而常被忽视的要素。为得到最佳的实验结果，实验人员要尽可能减少样品间交叉污染的可能，避免将核酸从一个实验带入下一个实验。以下措施有助于避免实验污染问题：

? 在样品准备和配制反应液过程中勤换手套

? 使用清洁的移液枪

? 只使用 PCR 级的水和 PCR 专用试剂进行 PCR 实验

? 用带旋盖的 EP 管稀释和配制反应液

四、数据分析

1．RT－PCR结束后，我们可以看到整个扩增阶段，分为四个阶段，对数据进行一个分析。

2．基线就是扩增曲线中的水平部分。

基线：反应荧光明显增加前的背景荧光值。默认为3－15Cycles的信号值。

3．阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限。

4．CT值是从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。

5．Real time PCR 灵敏性强，故对样品质量及引物质量要求很高。为避免非特异性扩增导致实验结果Ct值不准确，建议大家在每次实验时都要设置溶解曲线程序。只有溶解曲线为单一峰，才能认为实验数据可靠。

具体计算方式为：

先看Ct值，每个基因的三个平行中，舍去差异较大的值，求出平均值。

求组内△Ct＝组内目的基因 Ct – 内参 Ct

求组间△△Ct＝组间实验组的△Ct － control组的△Ct

求值：公式（power）＝2－△△C

以上便是从细胞RNA提取到Real Time PCR的全过程，在整个实验准备及操作过程都需要仔细小心、按要求进行操作，从而增加实验的成功率。

       原文标题 : 从RNA提取到Real Time PCR