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文章背景简介  

BACKGROUND INTRODUCTION

无细胞蛋白质合成系统（The cell－free protein synthesis system，CFPS）是一种以外源mRNA或DNA为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。与传统的体内重组表达系统相比，体外无细胞合成系统具有多种优点，例如：步骤相对简单、可表达对细胞有毒害作用或含有非天然氨基酸（如D－氨基酸）的特殊蛋白质、能够直接以PCR产物作为模板同时平行合成多种蛋白质、便于开展高通量药物筛选和蛋白质组学的研究……等。

细胞与无细胞蛋白质合成系统的比较（Khambhati K，  et al．  Frontiersin Bioengineering and Biotechnology， 2019， ）

2020年6月，美国加利福尼亚大学Luis E． Contreras－Llano等人在《Nature Communications 》（IF＝14．919）杂志上发表了题为“Holistic engineering of cell－free systems through proteome－reprogramming synthetic circuits”的文章，本文章研究强调了整体合成生物学方法在提高局部合成模块性能方面的实用性和潜力，证明了重组蛋白质是宿主细胞中翻译机制过度表达的直接结果。此外，还表明了在源菌株中使用质粒系统不会导致无细胞蛋白质合成系统（CFPS）的活性降低。

文章中，作者利用合成模块来表达大肠杆菌核心翻译机器的全部或子集的34种蛋白质，这些蛋白质被裂解并用于CPFS中的多株大肠杆菌BL21（DE3）中。选择在多个菌株中进行蛋白质过表达是为了减少蛋白质表达和质粒维护造成的代谢负担。质粒维护造成的负担表现为生长速度下降，这反过来又产生了较低浓度的核糖体和其他翻译机器蛋白。这已被证明是高效CFPS的一个限制因素。作者假设，翻译机器的过度表达应在两个方面有利于CFPS。首先，它应该通过提供翻译因子来补偿增加的代谢负担。其次，它应该将全部蛋白质组转变到一个类似于高生长率的状态，其中翻译因子被富集，细胞达到蛋白质合成效率的峰值。作者研究了两个不同的微生物联合体，一个有18个菌株（BL－18S），另一个有7个菌株（BL－7S），以获得富集翻译机器的细胞裂解物，而不需要纯化和补充单个蛋白质。为了研究标准CFPS反应中增加的翻译因子的影响，作者纯化了BL－18S中过表达的翻译机制蛋白，并将其补充为BL－E。deGFP的表达水平随着翻译机制的增加而成比例地增加。这些结果表明，蛋白质浓度的增加并不是导致多菌株CFPS系统蛋白质表达增加的唯一因素。此外，作者还通过质谱分析了几种全细胞裂解物的蛋白质组成。

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所用到的主要方法

METHODS  

CFPS系统反应

deGFP表达定量分析

半连续交换反应

质谱分析

透射电子显微镜观

SDS－PAGE

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文章主要内容摘要

ABSTRACT

合成生物学专注于结合宿主细胞操作的基因工程模块。为增强合成模块的功能，可以对宿主蛋白质组进行重编程改造。在这里，作者将整体合成生物学的概念应用到无细胞蛋白质合成系统工程中，利用细胞内代谢网络之间的联系，创造一个更有利于蛋白质合成的环境。具体来说，作者发现表达翻译机制的局部模块可以重新编程细菌蛋白质组，改变700多种蛋白质的表达水平。由此产生的反馈产生了一个无细胞系统，可以合成荧光检测基因、蛋白质纳米胶囊和基因编辑核酸酶Cas9，其表达水平比传统的无细胞系统高5倍。作者的研究用到了一种整体方法，该方法将合成生物学和系统生物学整合在一起，实现了仅通过局部代谢途径无法实现的结果。

       原文标题 : 通过蛋白质组重编程，对无细胞合成生物学系统进行整体工程设计