Biotech行业一直有句俗话，“只有政策下的行业，没有行业下的政策”。在这个资本市场的寒冬，利好政策的推出像冬天里的一团火苗，重新给予行业一些温暖和信心。5月10日，国家发展改革委印发《“十四五”生物经济发展规划》（以下简称《规划》），这是我国首部生物经济五年规划，明确提出了生物经济发展的阶段性目标和重点发展领域。《规划》指出要 “强化企业创新主体地位，发展壮大新型创新力量，要通过“助力疾病早期预防，提升疾病诊断能力，提高临床医疗水平”来“推动医疗健康产业发展”。“加快发展高通量基因测序技术，以高通量基因测序技术为主，重点开展肿瘤早期筛查”被首次提高到了“十四五”规划的高度。配合3月23日癌症筛查和早诊早治被列入《健康中国行动2022年工作要点》，肿瘤早筛似乎成为了乌云笼罩下的一道金边，蕴含了生物科技行业的光热与希望。5月16日，南京世和基因生物技术股份有限公司科创板IPO获受理。世和基因选择在此时冲刺IPO，并将肿瘤早筛早诊作为上市募集资金重点项目，希望鼓舞行业重拾信心，与大家携手共进。

背景

据Globocan 2020年的最新数据统计，中国每年新发癌症病例457万例，死亡病例300万例，均居全球首位。由于人口结构老龄化等原因，近10年来，我国恶性肿瘤发病率每年保持约3．9％的增幅，死亡率以2．5％递增，防控形势严峻。值得注意的是，不同分期的癌症患者治疗和预后都存在显著差异：早期肿瘤主要以手术等根治性治疗为主，治愈率可达90％左右；晚期肿瘤的治疗，虽然近年来在靶向药物和免疫药物方面取得了一系列突破，但5年生存率仍不足10％，晚期肿瘤药物的高昂费用也远超早期根治性治疗的费用。在我国，80％的癌症患者发现时已经是中晚期，导致我国肿癌症患者总体五年生存率不足30％，远低于发达国家70％以上的五年生存率。大量的研究和实践已经表明，肿瘤筛查和早诊早治可以有效延长肿瘤患者的总体生存期，减少疾病的经济负担。

临床上传统的肿瘤早期筛查手段，包括影像学筛查、内镜筛查及肿瘤标志物筛查等，普遍存在侵入性强、筛查过程存在较大不适感、准确性低（假阴性、假阳性）、依从性差等缺陷。目前，只有5种癌症的筛查方式获得了USPSTF（美国疾病预防工作组）的推荐（见表1），但即使是在这些已有SOC（Standard of Care， 标准诊疗方式）的癌种中，这些筛查方式的PPV（Positive Predict Value， 阳性预测值）也非常有限。临床上，还有大量癌种目前并没有标准肿瘤早筛手段。

表1． USPSTF推荐的癌症筛查方式和PPV

由于传统肿瘤筛查手段中存在的多种局限性，临床迫切需要一些敏感性／特异性更高且更便于操作的早筛技术。液体活检技术作为一种非侵入性的新型检测技术，在肿瘤早筛方面具有巨大的应用潜力。液体活检通过血液、唾液、尿液等体液样本对肿瘤信号进行检测分析，与传统组织活检相比，具有无创、实时动态监测、克服肿瘤异质性等优势，曾被MIT《科技评论》杂志评选为“2015年十大突破技术之一”，还被世界经济论坛与《科学美国人》杂志联合评选为“2017年度全球十大创新技术之首”。 这种快速、简便、无创的检测技术在当时被认为是未来极具潜力的肿瘤早筛早诊工具。现在，未来已至，随着国内外多家Biotech公司积极布局肿瘤早筛赛道，液体活检在肿瘤早筛中的应用研究正在如火如荼地开展当中。

液体活检

健康人正常生理活动过程中的细胞凋亡或坏死会生成游离的DNA双链小片段，并释放至外周血，称为循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）。肿瘤的生长离不开血液，在肿瘤生长更新的过程中，也会不断地向血液中释放来自恶性肿瘤的循环游离DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）和外泌体（Exosomes）等，这为液体活检实现肿瘤早筛提供了理论基础，也成为液体活检实现肿瘤早筛的重大挑战之一：如何从茫茫非肿瘤来源的cfDNA中寻找到肿瘤来源的ctDNA？这是个大海捞针的过程，而国外的俗语中也有“find needle in a haystack”的说法。尤其是肿瘤早筛突出一个“早”字，应用的对象为肿瘤早期甚至癌前病变的患者，这就进一步加大了检测的技术难度（图1：不同分期ctDNA含量），如何捕捉到肿瘤来源的信号成为液体活检早筛技术的关键。

图1． 乳腺癌中不同分期下血液cfDNA中肿瘤来源ctDNA含量

肿瘤来源的特征

液体活检的肿瘤标志物主要包括基因组、表观遗传学、转录组、微生物组、蛋白组和代谢组等层面。肿瘤标志物在ctDNA层面的特征主要包括点突变、片段化、拷贝数变异、甲基化等维度。

1

突变特征

在探寻其他几个特征的技术细节之前，先要谈一谈肿瘤早筛技术路线中提及相对较少，但却是肿瘤基因检测行业中应用最成熟的特征：点突变。

点突变其实是基因检测公司最得心应手的检测特征，毕竟大多数布局肿瘤早筛的Biotech公司都是做肿瘤晚期伴随诊断相关检测起家，之后逐渐将产品管线前移，最终覆盖肿瘤全周期。但是之前提及癌症早期血液中ctDNA含量很低，在肿瘤极早期10ng肿瘤患者的cfDNA换算成为150bp片段的数量大约在6x1010，其中肿瘤来源的ctDNA的片段数量大约在6x108，而肿瘤来源ctDNA中含有突变的片段只有6x105。与该结果相呼应的Nature研究表明，携带 1cm3肿瘤的早期患者ctDNA突变丰度在0．008％左右（95％ CI 0．002－0．03％），而基于NGS （Next Generation Sequencing，高通量测序）高深度测序的突变检测一般能够达到的检测极限为0．1％，ddPCR（数字PCR）能达到的检测极限为0．01％，均与早期患者的ctDNA突变丰度存在数量级上的差异。同时，单纯利用突变检测进行肿瘤早期筛查还需解决克隆性造血造成的干扰，以及由于突变通常缺乏肿瘤特异性、难以对肿瘤发生部位进行溯源的痛点。因此，目前在研的早筛产品中只用单纯突变作为特征的极少，多是联合突变和其他特征开展多组学检测。

2

甲基化特征

DNA甲基化异常是驱动癌症发生发展的重要表观遗传修饰之一，它往往在癌症病程的早期发生。肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体甲基化水平的降低与局部甲基化水平的升高。

全基因组DNA甲基化测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）是DNA甲基化研究的常用方法之一，通过亚硫酸盐处理（Bisulfite Treatment）和全基因组DNA测序结合的方式，对整个基因组上的甲基化情况和突变情况进行分析，具有单碱基分辨率，可精确评估单个C碱基的甲基化水平，从而构建全基因组精细甲基化图谱。

3

片段组学特征

片段组学依托于NGS技术，其特征主要包括拷贝数变异（CNV）、核小体印记（Nucleosome Footprint）、片段大小（Fragment length）以及片段末端序列特征（Motif）等。

拷贝数变异一般指长度为1kb以上的基因组大片段的拷贝数增加或减少，包括拷贝数变化（染色体臂的增加和丢失）以及由易位、扩增或缺失引起的重排。基因组拷贝数的异常通常会导致基因表达的改变，影响基因的正常功能，如拷贝数增加会引起ERBB2、MET等原癌基因的过表达，拷贝数缺失会导致TP53、RB1、BRCA1等抑癌基因的失活，进而导致细胞癌变。近年来，人们发现血浆DNA断裂并不是一个随机的过程。血浆cfDNA通常有一个显著的167bp的峰值分布，这主要与cfDNA形成机制有关：基因组DNA大约每147bp盘绕一个核小体，另外20bpDNA作为2个核小体之间的连接，在细胞凋亡的时候，DNA以每167bp进行剪切并被释放到血液中。有研究发现，癌症患者的血浆中cfDNA峰值分布更短，且与患者分期有一定联系，尤其对于高ctDNA水平的癌种：包括乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、肺癌等患者的cfDNA片段显著更短。由于血液中cfDNA的主要形式是受单个核小体保护的DNA，所以与甲基化模式类似，核小体定位变化也伴随着基因表达模式的转变，其在转录调控、DNA复制和修复等多种细胞过程及肿瘤发生发展中起着重要作用。因此肿瘤具有特有的核小体印记评分。核小体定位因细胞类型而异，因此也包含着cfDNA组织起源信息。末端基序（Motif）被定义为血浆DNA末端的几个核苷酸，癌与非癌具有不同偏好的末端切割模式。综上所述，片段组学依托于WGS（Whole Genome Sequencing， 全基因组测序），靶点覆盖于全基因组学层面。

肿瘤早筛技术路径的探索

面对众多肿瘤来源特征，迎难而上的肿瘤早筛公司们各显神通，不同技术路线的探索呈现百花齐放的态势，但最终都不约而同的落地在“甲基化”、“多组学”和“片段组学”这几个关键词上。从技术发展成熟度来看，NGS技术的出现使得ctDNA检测技术更加成熟，是目前液体活检早筛的主流技术平台。表2为国内外各公司早筛技术路径的总结。

表2． 国内外各公司早筛技术路径

1

甲基化路径

DNA甲基化是肿瘤早筛中运用最成熟的特征之一，多家公司都采用了甲基化的技术路线，包括国内的燃石医学、泛生子、鹍远生物、基准医疗等公司，也包括泛癌种早筛技术的龙头老大：美国癌症早筛公司Grail。

在这里要先提一句泛癌种早筛与单癌种早筛的区别。单癌种早筛是指针对特定癌种的检测，这就意味着某种癌症早筛的结果不能向患者或医生提供身体其他部位或其他类型癌症的信息，导致出现“diagnostic odyssey”的情况。泛癌种早筛可以通过一次检测对多种癌症进行筛查，同时进行组织溯源，即预测癌症发生部位，降低因为多次检测带来的假阳性率累积风险，减少对患者不必要的惊吓和过度诊疗。同时泛癌种早筛使得大多数缺乏SOC早筛手段的癌种早筛成为可能。但是，泛癌种早筛需要攻克的技术难点也更多，除了需要解决早期检测灵敏性的问题，由于同时检测多种癌症，假阳性率也是一个关键，因此提高检测特异性也是一个绕不过去的门槛。既要保证灵敏性，又要保证特异性，同时还要提供组织溯源的信息，所以泛癌种早筛一直是早筛领域的“哥德巴赫猜想”。如Grail在泛癌种早筛研发中就已投入大量资源，因为泛癌种早筛面向的是无症状的高危人群和亚健康人群，是早筛领域中最有临床需求与市场前景的方向。

Grail为了在自然人群中实现早筛，斥巨资启动了大型临床试验“循环游离基因组图谱研究”（Circulating Cell－free Genome Atlas，CCGA）。CCGA前瞻性多中心研究计划纳入超过15000例受试者（70％癌症患者，30％非癌症患者）并追踪5年，分析受试者cfDNA中的突变、拷贝数变异（CNV）、甲基化等基因组特征。2020年3月，Grail公布的数据表明，cfDNA靶向甲基化液体活检分析方法可区分多阶段的50多种癌症，包括缺乏筛查指南的高死亡率癌症和早期癌症，特异性＞99％，单一假阳性率＜1％。该检测对I–III期癌症的敏感性为43．9％，I–IV期敏感性为54．9％。在检测到癌症信号时，该检测还能以93％的准确度定位癌症的组织起源。CCGA－3最新数据显示，在总体人群中，基于靶向甲基化技术的肿瘤早筛模型检测特异性高达99．5％，灵敏度为51．5％，肿瘤信号定位准确率为88．7％。对于51．5％的灵敏度，一个问题是：在确保特异性的同时，如何进一步提升早期癌症的灵敏度？

2

多组学路径

“多组学”是肿瘤早筛，甚至肿瘤检测行业最热门的技术词汇之一。恶性肿瘤的发生涉及基因、表观遗传、转录组、微生物、蛋白和代谢等多个不同层次和不同维度的病理过程。如果只对单一组学的特征进行分析，会给靶点的筛选带来较大的局限性。而多组学特征整合分析一方面能够相互印证，增强检测结果的说服力；另一方面也能够多维度、全方位地捕捉癌症早期信号，提高灵敏度。

多组学技术分为低通量多组学与高通量多组学两种。目前在FDA或NMPA获批的两款肠癌早筛试剂盒均采用的是“低通量多组学”的技术路线。2014 年，美国 FDA批准了全球第一个通过粪便隐血和基因多靶点联合检测（FIT－DNA）用于结直肠癌筛查的产品Cologuard。该产品已被美国疾病预防工作组等多个权威组织推荐将其应用于适龄的无症状人群结直肠肿瘤早期筛查。作为Exact Science的核心产品，Cologuard利用了三种类型的生物标志物：NDRG4和BMP3基因的甲基化，KRAS基因的点突变和大便隐血中的血红蛋白。最终产品性能上，Cologuard表现出对结直肠癌92．3％的灵敏度，对进展期腺瘤42．4％的灵敏度，特异性为87％。2020年11月，诺辉健康用于肠癌无创早筛的产品“常卫清”获得国家药品监督管理局批准上市，用于体外定性检测粪便样本中的KRAS基因突变、BMP3 和NDRG4基因甲基化及血红蛋白，适用于年龄 40－74岁的结直肠癌高风险人群的筛查，技术路线与Cologuard类似。该产品的灵敏度及特异性分别达到91．9％和 87．1％，对于进展期腺瘤的灵敏度也达到了63．5％。

和瑞基因采取了“高通量多组学”的技术路线，基于高通量测序技术（NGS），其HIFI技术包括了一种表观遗传学特（5－羟甲基胞嘧啶）和三种片段组学特征（末端序列、片段分布和核小体印记），对肝细胞癌与肝硬化人群分类的灵敏度与特异性为95．4％与97．8％，对肝细胞癌与非肝细胞癌人群分类的灵敏度与特异性为95．4％与97．9％。值得注意的是，Exact Science升级的Cologuard2．0产品只保留了甲基化特征，在保持了95％的检测灵敏度的同时，将特异性提高到92％。

在多组学泛癌种方面，2018年Thrive Earlier Detection公司在Science上发表了CancerSEEK的研究结果。研究人员利用血浆ctDNA中的18个基因进行检测，同时通过质谱分析8种血浆蛋白markers，建立cfDNA＋蛋白的双重预测模型。该预测模型入组了812例健康人，1005例癌症患者，覆盖8个癌种（肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、食管癌、乳腺癌、卵巢癌）。其灵敏度可达70％，其中I期、II期、III期的灵敏度分别为43％、73％和78％。肿瘤患者器官溯源预测的平均准确性为83％。CancerSEEK研究与CCGA系列研究面临同样的问题：较低的I期肿瘤检测灵敏度应该如何解决？Thrive Earlier Detection于2020年被Exact Science收购，自此Exact Science也开始进军泛癌种早筛这个“明珠”领域。

3

NGS片段组学路径

提高肿瘤早筛灵敏度的方向之一，即可以加入多种其他组学维度的信息，也可以利用全基因组学测序（WGS），在基因组层面本身寻找更多的信号。DNA片段组学技术异军突起，在多项研究数据中均表现出优异的预测效能，为多癌种的早筛提供了新的研究方向。

DELFI在2019年Nature首次报道了cfDNA片段化特征在癌症和健康人之间的区别，通过1－2×全基因组测序（WGS），评估cfDNA片段化特征（包括整个基因组的片段大小和覆盖率、染色体臂拷贝数或线粒体拷贝数）并构建DELFI早筛模型。DELFI模型在 7 种癌症类型中的检测灵敏度为57％至99％ 以上，特异性为98％。值得注意的是，DELFI模型在I－II期癌症也表现出较高灵敏度；I－II期癌症敏感性分别为73％和78％［16］。DELFI在2021年公布了其肺癌早筛研究的结果，在特异性为80％的情况下，灵敏性为90％，其中I期肺癌的AUC为0．76。

在国内，除和瑞基因的多组学路线中纳入了片段特征外，世和基因自主研发的MERCURY技术，也主要采用cfDNA片段特征，通过机器学习将多种全基因组层面特征联合建模，用于区分肿瘤患者和非肿瘤患者，并在肿瘤患者中进行组织溯源。基于MERCURY技术，世和基因开展的DECIPHER系列大型早筛研究，也取得了不错的性能。其肠癌早筛模型在94．8％的特异性下，对进展期肠腺瘤和早期肠癌（0／I期）敏感性分别为95．7％和98％。肝癌早筛模型对肝癌与非肝癌人群分类的灵敏度与特异性为95．8％与98．8％，对肝癌与肝疾病人群分类的灵敏度与特异性为96．8％与96．1％。

如果采用已知突变作为区分肺癌的特征，特征数量大约在102左右，测序深度需要达到30，000x；如果采用已知的甲基化作为区分特征，特征数量大约在103左右，测序深度需要达到130－1000x［8］，这些已知固定化的特征Panel都只能代表肿瘤特征的拼图一角，无法阐明早期肿瘤的特征全貌。如果只聚焦基因组层面的某个特定区域或特征，对测序深度、样本量、样本多样性要求可能较高。基于全基因组测序的片段组学能够充分利用106数量级的肿瘤特征，信号更为丰富。值得注意的是，一向采取甲基化技术路线的鹍远生物，在今年AACR poster的结果中展示了采用片段模式与突变检测联合的方式预测肺癌，其模型的AUC为0．87。

4

技术路径的选择

技术上的不断突破是产业生态蓬勃发展的标志。对于场内玩家来说，“不管黑猫白猫，抓到老鼠的就是好猫”。但是在市场驱动下的技术研发，早筛产品最终能否被市场长期接受，不仅在于检测性能，更与成本控制和技术能否自我迭代息息相关。

随着高通量测序技术进入各项临床共识，临床专家对NGS检测的了解度和认可度大大提高。随着NGS成本的不断降低，NGS检测技术在产品价格、通量、效率和可拓展性方面的优势也在不断凸显。此外，一项新技术能否可持续发展还在于其是否有自我迭代功能，能否通过应用过程中产生的数据再次进入产品更新的循环中去使其具备长期领先的优势。在这个更新迭代的过程中，会产生新的研发成本。NGS技术在生成了全基因组层面的数据后，只需要通过优化模型算法对不同的特征进行排列组合，即可完成换代升级。所以，新产品研发过程中，技术模块和平台能否反复使用、持续升级是降低研发成本的关键：选择什么样的技术路线作为起点，对后续是否有持续研发的能力至关重要。

从技术研发到公司投入巨大资源开展前瞻性临床研究，还有一个成果转化的过程。大型研究能够更全面地反映真实世界的总体情况，避免单一研究机构可能存在的局限性，提高样本的多样性与丰富度，有利于进一步提高早筛模型的稳定性和普适性，为其在临床中的广泛应用做好技术铺垫。对于泛癌种研究来说，不同癌种的肿瘤释放的ctDNA含量不同（图2：不同癌种血液中ctDNA的检出率），因此如何保障泛癌种早筛模型在多种癌种中的检测性能尤为关键。是否具有阶段性的学术研究成果是衡量一条技术路线是否成熟到能够进入前瞻性研究阶段的重要指标。表3总结了国内外大型研究主要发表情况。

图2．不同癌种血液中ctDNA的检出率

表3． 国内外大型研究主要发表情况

5

前瞻性研究

“实践是检验真理的唯一标准”，对于早筛技术来说，已有肿瘤早筛的相关研究显示，早筛技术的成熟落地均需经过真实世界的数据验证，需要大规模的前瞻性队列研究来验证该技术在预期筛查人群中的真实性、准确性和可靠性。因此大规模前瞻性队列研究是早筛技术进入广泛市场推广的前置条件，这对企业的资金储备水平、资源调配、临床管理能力都是不小的挑战。

在前瞻性研究上，Grail一直敢为人先，先后大手笔的投入了PATHFINDER，STRIVE，SUMMIT和NHS－Galleri等多项前瞻性临床研究。其中PATHFINDER在2021年ASCO上公布的中期研究结果显示其肿瘤检测总PPV为44．6％， top2溯源的总准确性为96．3％。Grail在2021年启动了与英国NHS合作的研究NHS－Galleri，计划入组14万50－74岁3年内无肿瘤史的人群，对每名入组者采血3次（入组、1年后、两年后），并随访多年。

Thrive的DETECT－A研究是全球首项前瞻干预性临床研究，招募10，006名年龄在65－75岁之间的健康女性，受试者进行了两次血液检查，分析内容包含16个常见突变基因及9个血清肿瘤标志物，结果显示其特异性达98．9％，结合PET－CT等影像学检查，特异性可达99．6％。国外Exact Sciences、Guardant Health、DELFI和Freenome在这两年纷纷启动前瞻性研究，国内公司也于近两年相继公布了其前瞻性队列研究计划，包括：燃石医学、鹍远生物、世和基因、和瑞基因、诺辉健康、泛生子和基准医疗。（见表4）

表4． 国内外公司早筛前瞻性研究

评价一项早筛技术的性能指标在大多回顾性研究中会采用灵敏性、特异性，在前瞻性研究中会更强调其PPV和NPV（Negative Predict Value， 阴性预测值），虽然作为跷跷板两端的NPV和PPV，谁在临床实践中更重要，谁在监管方评审中更倾向，国内外均有争议。但是肿瘤早筛真正的primary endpoint是其能否改变临床结局：短期来说早筛能否带来分期的前移，晚期肿瘤发病率的下降，长期来说早筛能否带来肿瘤死亡率的下降，发病率的下降，五年生存率的提高，这些才是肿瘤早筛的终极目标，也是只有通过前瞻干预性临床研究和真实世界数据才能够评估出的结果。

总结

为提高中国居民癌症生存率，实现肿瘤早筛的技术突破和肿瘤早筛的民众普及一直是政策鼓励的对象。根据国家《健康中国行动2022工作要点》，肿瘤早筛符合要点中要求推进的“癌症筛查和早诊早治”的需要。根据“肿瘤诊疗质量提升行动计划”，肿瘤早筛也实施符合计划中所明确的“安全、有效、经济的筛查方法”，符合计划中“提高肿瘤早期识别能力和机会性筛查水平，促进早诊早治”的需要。在政策红利加持，技术创新进步，临床认可，国民健康管理意识提高和临床急需的多重驱动下，早筛赛道熙熙攘攘，各家公司各显神通，努力推动肿瘤早筛产品的研发和落地，携手为“早发现、早诊断、早治疗，实现全面健康”这个14亿人的“健康中国梦”贡献属于中国的创新力量。早筛技术最终群雄谁能涿鹿，让我们拭目以待。

       原文标题 : ?肿瘤早筛的前瞻性研究