前言

抗体偶联药物（ADC）在过去几年中取得了巨大的发展势头，十多种ADC药物被监管机构批准用于临床癌症治疗。目前人们着重于开发特定位点的偶联方法，通过引入特异性氨基酸或非天然氨基酸残基、肽和聚糖，通过抗体工程实现选择性抗体偶联。

除了使用合成细胞毒素外，这些新方法还被应用于偶联其他有效载荷，如非细胞毒性化合物、蛋白质/肽、聚糖、脂质和核酸。非细胞毒性化合物包括聚乙二醇、抗生素、蛋白质降解剂（PROTAC和LYTAC）、免疫调节剂、酶抑制剂和蛋白质配体。不同的小分子蛋白或多肽已经可以通过非天然氨基酸使用点击化学、C-末端工程化甲酰基甘氨酸以及酶或无酶特异性转肽反应偶联。这些含有新型有效载荷的位点特异性抗体偶联药物（AXC）正处于概念验证和临床前开发阶段，将可能产生新的治疗方法，以解决目前未满足的医疗需求。

位点特异性抗体偶联

位点特异性抗体偶联始于单克隆抗体的工程化或修饰，然后是优化的药物连接子的缀合。抗体通过IgG的Fab或Fc区进行工程设计，通过使用基因工程、代谢标记或化学酶修饰引入不同的结合位点。

 位点特异性抗体偶联可以通过基因工程引入特定的位点，例如半胱氨酸（Cys）、谷氨酰胺（Gln）、非天然氨基酸（对乙酰苯丙氨酸和对叠氮甲基-L-苯丙氨酸）或短肽标签。通过Cys的偶联相对简单直接，不需要特殊的试剂或酶。THOMABTM是通过工程化Cys进行的位点特异性偶联，是正在开发的首批位点特异性抗体-药物偶联方法之一。在动物模型中，使用这种方法产生的ADC不仅表现出高度均质性，而且在体内表现出更高的疗效和治疗指数。

此外，位点特异性偶联也可以通过使用包括转谷氨酰胺酶、转肽酶/分选酶、糖基转移酶或内糖苷酶在内的多种酶的化学修饰方法来完成。特异性短肽标签内氨基酸的酶修饰产生的抗体偶联药物具有高选择性和稳定性，然而其引入的肽标签的潜在免疫原性目前尚不清楚。目前，通过工程化Cys、非天然氨基酸和酶聚糖重塑的位点特异性偶联已经大规模进行，并且产生的多个抗体偶联药物正在临床试验中进行测试。

非细胞毒性化合物有效载荷

目前，有几种非细胞毒性化合物用于位点特异性偶联，如聚乙二醇（PEG）、抗生素、免疫调节化合物、蛋白质降解剂以及在癌症中过表达的受体和蛋白质的配体。

PEG

为了延长抗体片段的半衰期，20多年前首次描述了Fab通过铰链Cys残基的PEG化。由于PEG的附着点远离表位结合区，因此与未修饰的Fab相比，PEG化的Fab的抗原结合和体外生物活性通常不会降低。聚乙二醇化也不影响稳定性，而抗体片段的半衰期可以显著增加。聚乙二醇化抗TNF Fab，Certolizumab pegol，已被监管机构批准用于治疗免疫介导的炎症性疾病患者，而其他聚乙二醇化Fab也正在进行临床前和临床开发。

抗生素

一种新型抗体-抗生素偶联物（AAC）正在开发，作为一种潜在的治疗方法可有效杀死细胞内细菌。使用THIOMATM方法，将一种只有在溶酶体中释放后才被激活的高效抗生素rifalogue与抗金黄色葡萄菌抗体轻链上的V205C位点特异性偶联。AAC在体内治疗菌血症和消除细胞内金黄色葡萄球菌感染方面优于万古霉素。AAC提供了一种针对细胞内细菌感染的独特治疗方法，目前正在临床开发中（NCT03162250）。

免疫调节化合物

合成的非细胞毒性酶抑制剂或特异性受体的配体已通过与抗体位点特异性偶联，用于免疫调节。如磷酸二酯酶4（PDE4）的酶抑制剂，将高效PDE4抑制剂与抗CD11a抗体偶联，免疫偶联药物迅速内化入免疫细胞，并抑制脂多糖诱导的原代人单核细胞分泌TNF-α。其在小鼠模型中显示出体内抗炎作用。

此外，基于几种肝X受体（LXR）激动剂诱导胆固醇反向转运和抗炎的能力，将LXR激动剂与抗CD11a抗体偶联，单核细胞CD11a表达的增加已被发现与动脉粥样硬化性冠状动脉狭窄相关。该偶联药物具有对溶酶体组织蛋白酶B敏感的可裂解接头，免疫偶联物在体外特异性诱导人THP-1单核细胞和巨噬细胞中的LXR激活，而在肝细胞中没有显著作用。

蛋白降解剂有效载荷

近年来，位点特异性抗体偶联被应用于蛋白质降解领域。蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）依赖于合成的嵌合分子通过蛋白酶体在细胞内降解蛋白质靶标。PROTAC在药物发现中的应用在过去十年中取得了重大进展，然而，依然存在一些挑战，如溶解度和体内药代动力学。使用PROTAC位点特异性抗体偶联，可能会提供一些更优的替代方法。

例如，一些PROTAC化合物已被鉴定用于降解含溴结构域的蛋白质-4（BRD4），然而在小鼠静脉或口服给药后，表现出不利的理化特性和较差的体内药代动力学。因此，通过甲硫磺酰基Cys偶联，将这些PROTAC偶联到抗C型凝集素样分子-1（CLL1）的抗体上，该抗体经工程化改造具有三个不成对的半胱氨酸残基（LC-K149C、HC-L174C和HC-Y373C），每个抗体可能连接六个PROTAC（DAR为~6）。在携带HL-60（急性髓细胞白血病）细胞异种移植物的小鼠中，单次静脉注射抗体-PROTAC偶联药物可产生剂量依赖性的肿瘤生长抑制。此外除了PROTAC，位点特异性偶联也被应用于溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）。

蛋白质和多肽的有效载荷

目前，蛋白质或多肽也已被用于位点特异性抗体偶联。例如，一种新的抗体-唾液酸酶偶联药物，在抗HER2抗体重链的C末端附近引入短肽标签LCTPSR通过酶反应生成叠氮化物，然后通过点击化学将含叠氮化物的抗体偶联到唾液酸酶上。抗体唾液酸酶偶联药物对HER2阳性癌症细胞的ADCC活性增强。活性增加与癌症细胞脱乙酰化、自然杀伤细胞（NK）与抑制性Siglec受体的结合减少以及与NKG2D的结合增强有关。

此外，也有研究探索抗体与癌症中过表达蛋白质的配体位点特异性偶联。例如，将抗CD3 Fab或scFv偶联到这些配体上以产生双特异性T细胞接合器。在一项研究中，一种非天然氨基酸pAcF被掺入抗CD3 Fab的两个不同位置（LC-S202和HC-K138），将工程化Fab与前列腺特异性膜抗原（PSMA）的合成高亲和力配体偶联。该双特异性T细胞接合器在体外对前列腺癌症细胞株表现出强大的细胞毒性，在体内也表现出良好的抗癌效果。

AMG133是抗GIPR抗体与GLP-1多肽的偶联药物，AMG133分子中抗体偶联的GLP-1多肽分子经过改造，在多肽的第8位和第22位引入非天然氨基酸Aib，增加了多肽部分的血浆稳定性和半衰期。抗体分子的重链引入了E384C位点突变，通过cys的巯基将多肽偶联至抗体重链Fc区域。其在肥胖患者的1期临床试验中显示出卓越的减重药效。

核酸有效载荷

siRNA是一种21-25核苷酸的双链复合物，在诱导特定mRNA的降解和抑制其翻译方面具有高度选择性。为了增强特异性组织或细胞递送，已经做出了许多努力来开发位点特异性偶联方法，以产生抗体-siRNA偶联药物（ARC）。

Song等人首先研究了使用非共价复合物递送siRNA的方法。使用重组方法将来自抗gp160（HIV包膜）Fab片段的重链的C末端与鱼精蛋白融合，鱼精蛋白含有许多与DNA相互作用的带正电荷的氨基酸残基。然后将来自Fab-鱼精蛋白融合物与siRNA杂交，siRNA可以被递送并沉默HIV-1包膜细胞中的基因表达，并抑制HIV在T细胞中的复制。与鱼精蛋白融合的HER2单链抗体也能将siRNA特异性地传递到HER2阳性的乳腺癌症细胞中。

此外，siRNA也可以与抗体中特定位点进行直接偶联。Cuellar等人首次报道了使用THIOMBTM方法将抗体与siRNA直接偶联。他们选择了七个针对不同内化程度靶点的抗体，这些抗体在重链（A118C）或轻链（V205C）中引入了不成对的Cys，然后和其他几个基因特异性的siRNA偶联。在体外测试的ARC中，在表达高抗原水平的细胞中，两种表现出中度基因沉默（≤50%沉默），一种（抗TENB2-siRNA偶联药物）表现出最高沉默（>50%）。

目前，抗体-寡核苷酸偶联药物已开始进入临床。几家生物技术公司针对许多不同的适应症进行试验，包括罕见病、中枢神经系统疾病和癌症。这些位点特异性抗体-寡核苷酸偶联药物为未来许多未满足的医疗需求创造了巨大的机会。

小结

作为下一代方法，位点特异性抗体偶联为生产具有改善治疗指数的同质ADC提供了巨大的潜力。随着抗体工程方法的不断进步，许多新方法已经被开发出来。它们已被应用于偶联许多不同的有效载荷，包括非细胞毒性化合物、小蛋白/肽和siRNA，而不仅仅是ADC的合成细胞毒素。这些独特的抗体偶联物拥有巨大的潜力开发针对不同疾病的新疗法，造福患者。

参考文献：

1.Site-Specific Antibody Conjugation with Payloads beyond Cytotoxins. Molecules. 2023 Jan 17;28(3):917

       原文标题 : 位点特异性AXC新型有效载荷