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文章背景简介   

BACKGROUND INTRODUCTION

上个世纪，外源化学诱导剂和可溶性转录因子（TFs）在基因调控中的应用是促进生物技术和合成生物学快速发展的主要动力之一。然而，由于其可逆性有限、诱导剂的转运基于扩散，存在着潜在的脱靶效应、转运延迟和毒性等多种缺陷。

光遗传调控具有无创性、可逆性和高时空分辨率等优点，有效突破了生化调控的限制。研究者将光遗传工具应用于真核细胞的表达调控。 Yang等人开发了Lighton和Lightoff系统，报道了一个适用于酿酒酵母的只包含一个单体光敏蛋白LVAD的Ylighton系统。它是Lexa-VVD(LevI)和Gal4蛋白(Gal4AD)激活结构域的融合， 以EL222为基础构建了酿酒酵母光调控基因表达系统，该系统能产生8.49±0.31g/L异丁醇和2.38±0.06g/L 2-甲基-1丁醇。 Wu等人以EL222为基础，构建了斑马鱼光遗传表达系统TaEL。Litoralis红杆菌的光敏蛋白EL222是基于光诱导同二聚反应的系统之一，由222个氨基酸(AA)组成。 EL222的N端为光氧电压(LOV)结构域，C端为螺旋转螺旋(HTH)结构域。 当EL222受到蓝光照射时，黄素单核苷酸(FMN)与LOV的结合使Jα螺旋偏离LOV，从而释放HTH，使EL222同二聚并与被称为克隆1-20 bp(C120)的调控元件结合。在黑暗中，FMN与LOV解离。 LOV回到基态，抑制HTH与DNA的结合， EL222自发逆转，导致EL222同聚物迅速解聚和失活。

作为真核生物，毕赤酵母（Pichia pastoris）具有真核表达系统的许多优点，如蛋白质加工、折叠和翻译后修饰等。与其他真核表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有更快、更简单、更便宜、表达水平更高的特点。然而，最常用的诱导剂甲醇具有剧毒和易燃的特性，在生产过程中我们很难对甲醇进行监测。因此，迫切需要探索一种新的调控方法。光遗传调控可以有效地避免传统化学诱导剂的缺点，是调控P.pastoris表达的良好方法。

华中科技大学Zhiqian Wang等人，开发了一个名为pBctrl的光开关基因表达系统用于P. pastoris基因工程表达。该系统包括一组专门设计用于匹配P. pastoris中的EL222的光调节启动子。在定制启动子的帮助下，蓝光激活转录因子VP16-EL222在P. pastoris中起作用。最高感应比达到79.7倍。此外，pBctrl系统被证明对基因表达具有可逆、快速、定量和时空控制。当使用重组脂肪酶作为报告基因时，可以观察到酶的活性和过表达。这种设计易于在实验室中实施，并提供了一种新颖、快速、无污染的毕赤酵母表达系统的诱导方法。2022年11月，他们在ACS Synthetic Biology期刊（生物2区 IF 5.25）发表了“Design and Characterization of an Optogenetic System in Pichia pastoris”，文章详细描述了该系统的设计、构建和表征，并对其应用进行了实验验证。该研究为毕赤酵母中基因调控提供了一种新思路，具有重要的理论和应用价值。

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所用到的主要方法

METHODS   

1、PBCTRL的构建 

2、倒置荧光显微镜观察

3、共焦荧光成像

4、照明和光学测量

5、酶标仪测量

6、流式细胞术

7、琼脂平板显像

8、脂肪酶活性定量测定

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文章主要内容摘要

ABSTRACT 

毕赤酵母（Pichia pastoris）是商品化生产许多有价值蛋白质的主要宿主系统。传统上，毕赤酵母中的基因表达调控是通过甲醇诱导实现的，但这种方法存在毒性和易燃性等问题。光遗传技术提供了一种替代和更清洁的基因调控方法。本研究利用光敏蛋白EL222设计了一种新型“单组分”光遗传系统，在蓝光下诱导表达，最高诱导比为79.7倍。该系统具有简单、高效、可重复性好等优点，并且可以通过合理设计来进一步改进和扩展其应用。本研究为毕赤酵母中基因调控提供了一种新思路，具有重要的理论和应用价值。

简而言之，本文的主要研究内容有：

1. 基于 el222的 gs115表达系统的设计

2. 蓝光诱导单个细胞集落的激活

3. 剂量依赖性激活   

4. 在单细胞水平上评估性能

5. 光开关空间激活

6. pBctrl 系统的时间行为

7.   重组脂肪酶的表达

       原文标题 : 一种毕赤酵母基因工程表达的光遗传调控系统