假单胞菌基因组CRISPR-Cas系统的比较分析

2024-01-08 18:41

文章背景简介

BACKGROUND INTRODUCTION

假单胞菌是革兰氏阴性需氧细菌，有180多种。假单胞菌广泛分布于自然界，如土壤、水、食物和空气中。有荚膜、鞭毛和菌毛。营养要求不高，种类多，与人类感染有关的主要有铜绿假单胞菌(P. arugino.sa)、类鼻疽假单胞菌(P．pseudomallei)、荧光假单胞菌(P．fluorescens)等。铜绿假单胞菌是常见条件致病菌，特别是医院感染；类鼻疽假单胞菌可引起局部地区（东南亚）人和动物的类鼻疽病；输入荧光假单胞菌污染血液或血制品，可导致败血症或休克。

超过25种假单胞菌与人类和动物的机会性感染有关。不过，尽管假单胞菌的一些致病种会引起安全问题，但许多假单胞菌在工业、医药、农业、环保等领域中也有应用价值。例如，可用于植物病原真菌（如雪霉叶枯菌、镰刀菌、棉花黄萎病菌、炭疽菌等）及病虫害的生物防控。还可通过其产生的植物整张激素，发挥对对植物生长的促进作用。在环境保护方面，假单胞菌主要可被用于化学农药的降解、废水处理、油污处理等。在医药方面的研究也有报道，例如，研究有从假单胞菌中分离出具有抗肿瘤活性的大环类酯类化合物OximidinesI 和II，并有利用假单胞菌外毒素与单克隆抗体结合抗肿瘤的报道。

近些年来，CRISPR/Cas系统作为基因编辑工具，已经广受关注。但事实上，CRISPR/Cas系统本身是原核生物的一种获得性免疫系统，用于抵抗存在于噬菌体或质粒的外源遗传元件的入侵。CRISPR/Cas系统是存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种防御机制，以消灭外来的质体或者噬菌体的DNA。CRISPR序列是由可以感染原核生物的噬菌体DNA片段衍生来的。它可以检测并摧毁能引起相似感染的其他噬菌体中相似的DNA，因此对原核生物抗噬菌体至关重要。它是由富含AT-的前导序列与跟随其后的，被短重复序列隔开的特殊间隔序列（spacer）所组成。这些短序重复序列一般由28-37个碱基对组成（总范围23-55碱基对）。而spacer一般由32-38碱基对组成（21-72bp）。新的spacer可以在免疫系统被新的噬菌体感染后出现，但是一般整个基因中只有少于50组的重复序列-spacer序列。CAS则是一种核酸内切酶。可以利用CRISPR序列中间隔序列（spacer）对应的RNA指引，识别并且切割特定与其序列互补的DNA链。

近年来，人们逐渐发现，假单胞菌的致病性、对物理化学条件的耐受性，甚至微生物代谢和生物循环等方面，与其CRISPR-Cas系统也有密切的相关性。研究表明，CRISPR-Cas系统调节假单胞菌的生物膜生成和聚集行为。

在假单胞菌属基因组中寻找CRISPR结构具有重要意义，因为它有助于研究这些遗传元件在各种环境中的多样性和分布。

2023年6月，苏利亚大学Ángel Parra-Sánchez等人在《Genes》（SCI基因与遗传学分区2区，IF=3.5）上发表了题为“Comparative Analysis of CRISPR-Cas Systems in Pseudomonas Genomes”的文章，分析了不同环境下假单胞菌基因组中CRISPR-Cas系统的存在。

所用到的主要方法

METHODS

1、 CRISPR结构的鉴定

2、CRISPR相关基因(CAS)和CAS蛋白的鉴定与比较

3、间隔序列起源和多样性的确定

4、原间隔物邻近基序(PAMs)与自靶向的鉴定

5、直接重复序列(DR序列)保守性的测定和RNA二级结构的预测

6、统计分析

文章主要内容摘要

ABSTRACT

假单胞菌中有一些是来自陆地的腐生菌，另一些与人类和动物的机会性感染有关。其致病性或代谢方面的因素与CRISPR-Cas有关，对其进行的计算机研究更多地集中在临床和非环境设置上。

这项研究旨在对假单胞菌基因组中存在的CRISPR-Cas系统进行计算机分析。研究分析了NCBI数据库中275个假单胞菌的完整基因组序列。从CRISPRdb获得了CRISPR基因座。利用BLAST对与CRISPR (cas)和cas蛋白相关的基因、间隔序列的起源和多样性进行了鉴定和比较。利用WebLogo 3.6对自靶向序列、PAM和DR序列的守恒性进行了可视化分析。使用RNAFold和MFold分析了CRISPR-like RNA二级结构预测。结果显示：在19.6%的假单胞菌中鉴定出了CRISPR结构。总共发现了113个典型的CRISPR序列，其中有18个推测的Cas基因，还有2050个间隔序列，其中52%与噬菌体同源，26%与染色体同源，22%与质粒同源。在CRISPR阵列中未检测到潜在的自靶向。所有发现的DR序列都能形成热力学稳定的二级RNA结构。本研究对CRISPR/Cas系统的比较有助于了解临床和环境相关物种各进化谱系的环境适应性，为非常规CRISPR的细菌分型、可追溯性、分析和探索提供了数据支持。

简而言之，本文的主要研究内容有：

1、分析假单胞菌CRISPR基因座。

2、检测假单胞菌CRISPR阵列是否有自靶向。

3、分析DR序列是否形成稳定的二级结构以及形成二级结构的热力学参数的计算。