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文章背景简介   

BACKGROUND INTRODUCTION

作为典型的甲基营养酵母之一，毕赤酵母（也称为Komagataella phaffii）不仅被广泛用作异源蛋白表达的优良宿主，而且在有效生物合成经济化合物如nootkatone（诺卡酮）、类胡萝卜素、叶黄素、蓖麻油酸、透明质酸和达美烯二醇II等方面表现出良好的潜力。

使用甲醇作为碳源是巴斯德毕赤酵母最有利的特性之一。来自甲醇利用（MUT）途径的几个启动子被鉴定为甲醇依赖性强启动子，如PAOX1（醇氧化酶1的启动子）、PFLD1（甲醛脱氢酶1的启动基）和PDAS（二羟基丙酮合酶的启动子）。相反，PPEX8（过氧化物酶体基质蛋白的启动子）或PAOX2（醇氧化酶2的激活子）被归类为弱启动子。考虑到这些启动子受到甲醇的严格调控，当使用甲醇作为碳源和诱导剂时，它们可用于有效生产外源蛋白。

由于毕赤酵母能够进行快速和高密度发酵，它不仅被用作异源蛋白表达的优良宿主，而且在小分子化合物的有效生物合成方面表现出良好的潜力。然而，巴斯德毕赤酵母的基础研究远远落后于酿酒酵母，导致缺乏可用的生物元素。特别是，在毕赤酵母中，可用于外源蛋白表达或生物合成途径构建的强内源性启动子元件较少。

为了从毕赤酵母鉴定更多可用的内源性启动子，浙江大学医学院药物生物技术研究所Weiwang Dou等人开展了相关研究，并于2021年8月在《Microbial cell factories》（IF=6.4，Q1）发表了题为“Screening and evaluation of the strong endogenous promoters in Pichia pastoris”的文章。

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所用到的主要方法

METHODS   

1、酵母在不同碳源培养基中生长曲线的测定

2、RNA-seq分析

3、实时定量PCR（RT-qPCR）分析

4、PXXX-lacZ载体的构建及酵母转化

5、β?半乳糖苷酶活性测定

6、β-胡萝卜素生物合成途径启动子库的构建

7、β-胡萝卜素产量的测量

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文章主要内容摘要

ABSTRACT 

尽管大多数研究都集中在强启动子上，但值得注意的是，强启动子不适合用于某些应用。例如，具有中等表达水平的启动子有时更适合用于转运蛋白或伴侣表达。因此，还应重视对具有不同转录活性的各种启动子的研究。该研究基于RNA-seq数据和LacZ报告子系统，筛选出8个在三种常用培养基中表现出较强转录活性的新型内源性启动子，选择了一种异质性β-胡萝卜素生物合成途径来进一步评估这些启动子的可用性。研究还发现，同时多次使用同一启动子可以产生显著的竞争效应，这可能会显著降低靶基因的转录表达水平。

该研究基于RNA-seq和LacZ报告子系统，在三种常用培养基中筛选出8个有助于提高转录表达水平和β-半乳糖苷酶活性的强内源性启动子。其中，P0019、P0107、P0230、P0392或P0785所贡献的转录表达水平在生长的对数期和稳定期基本不变。P0208或P0627的转录水平表现出生长依赖性特征（对数期表达水平较低，稳定期表达水平较高）。在生长60小时后，P0208、P0627、P0019、P0407、P0392、P0230、P0785或P0107贡献的β-半乳糖苷酶活性相对低于PGAP，但高于PACT1。本研究为了评估这些启动子的可用性，将其中几个启动子随机应用于巴斯德毕赤酵母的异质性β-胡萝卜素生物合成途径，这些突变体的β-胡萝卜素最高产量可达1.07 mg/g。此外，同时多次使用同一启动子可以产生显著的竞争效应，这可能会显著降低靶基因的转录表达水平。

该研究中鉴定的新型强内源性启动子增加了毕赤酵母中可用的启动子元件的数量。研究观察到的竞争效应表明，当在一个酵母菌株中同时使用相同的启动子进行繁殖时，需要仔细的预评估。这项工作也为巴斯德毕赤酵母的工程应用提供了一种有效的策略来识别更多新的生物元素。

简而言之，本研究的主要内容有:

1、基于RNA-seq筛选不依赖于碳源的潜在强启动子

2、候选启动子转录活性的比较

3、P0208和P0627是新的生长依赖性启动子

4、通过异质性β-胡萝卜素生物合成途径评估候选启动子

5、在酵母菌株中多次使用一个启动子时存在显著的竞争效应

       原文标题 : 毕赤酵母强内源启动子的筛选与评价