前言

CpG 寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）是一种免疫调节合成寡核苷酸，通过特异性地刺激Toll样受体9（TLR-9），诱导细胞免疫和体液免疫，增强机体免疫应答。机体在感染后，病原体表达的进化上保守的分子结构可以触发先天免疫反应，这些结构被称为病原体相关分子模式，被宿主TLRs识别。病原体相关的分子模式，如脂多糖和脂蛋白被TLR4和TLR2识别；细菌的鞭毛蛋白被TLR5识别；dsRNA被TLR3识别，而ssRNA被TLR7/8识别；存在于细菌和病毒DNA中的未甲基化CpG基序被TLR9识别。

TLR激活引发的先天免疫反应的特征是产生促炎细胞因子、趋化因子、I型IFN和抗菌肽。随后，宿主产生适应性免疫反应，产生高亲和力抗体，并产生细胞毒性T细胞，提供杀菌免疫并保持免疫记忆，以防止随后的感染。由于CpG能够有效地诱导先天免疫反应，并有助于适应性免疫，因此它们作为疫苗佐剂的潜在应用备受关注。

CpG的种类

根据化学结构和生物学活性，CpG-ODNs 可分为 A，B 和 C 3种类型。其中，B 型 CpG是发现最早、研究得最清楚的类型。它由一个或多个CpG基序组成，通常位于硫代磷酸酯骨架上。与天然磷酸二酯酶核苷酸相比，这种主链增强了对核酸酶消化的抵抗力，为其提供了更长的体内半衰期（30–60分钟，而磷酸二酯酶为5–10分钟）。B型CpG触发浆细胞样树突状细胞（pDC）分化并产生TNF-α，并刺激B细胞增殖和分泌IgM。

A 型 CpG以含有CpG 二核苷酸的回文序列为核心，两端为 poly G尾，磷酸二酯键骨架为部分硫代修饰。这类 CpG通过回文序列和 poly G 形成高级结构，能够活化 pDC 诱生大量 I 型干扰素，但对B 细胞活性很弱。B型CpG与A型CpG的不同活性很大程度上是由于CpG/TLR9复合物在pDC内体中的保留时间不同。B型CpG通过早期内体快速转运到晚期内体，而A型CpG在早期内体中保留的时间更长。A型CpG这种结构特征可导致CpG 分子在溶液中形成复杂多聚体，因此其在临床上的研究一直进展缓慢，最近研究集中在将其包装成稳定的病毒样颗粒（VLP），用作佐剂使用。

C型CpG在完全由硫代磷酸核苷酸组成方面类似于B型，但在包含回文CpG基序方面类似于A型，因此可以形成茎环结构或二聚体。它兼具 A 和 B 型 CpG的活性，既能活化pDC，又能活化 B 细胞。

不同 CpG 基序作用于不同物种引起的免疫刺激效应有所差异，具有种属特异性，同时 CpG 的核心序列、回文结构等均对其活性有显著影响。

CpG的基序

1995 年发表的论文中首次提出了CpG 基序的概念。CpG 基序是指以非甲基化 CpG 为核心、5' 端为 2个嘌呤、3' 端为 2 个嘧啶的六核苷酸序列，如GACGTT 和 AACGTT 等。CpG 基序中CpG 二核苷酸为活性所必需，旁侧序列也与活性密切相关，不但决定活性的强弱，后来还发现决定活性的种属特异性。

美国 Coley's公司在1998-2000年间发现了首个具有高度免疫刺激活性的人CpG基序 GTCGTT， Coley's公司根据 GTCGTT 设计了 CpG-2006 (又名 CpG-7909)。同时，研究还发现了另一个活性相似的 人 CpG 基 序GTCGTC。与小鼠 CpG 基序不同，这两个人源CpG 基序 5' 端第二位为嘧啶，而不是嘌呤，从而表明存在种属特异的 CpG 基序。通过比较不同突变体对人和小鼠免疫细胞的活性，最终确定活化人免疫细胞的CpG 基序为 TCGT，而活化小鼠免疫细胞的 CpG 基序为 A/TCGTT (5' 端第一位 A 活性强于 T) 。该发现不但修正了以前对CpG 基序的理解，更重要的是发现了对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的 CpG 基序 TCGTT，研究人员今后可以方便地使用小鼠模型来研究CpG的潜在临床应用价值。

CpG的种属特异性

现已明确 TLR9 对CpG的识别是脊椎动物免疫系统识别病原微生物的一种先天性免疫应答机制。物种分化、TLR9变异和自然选择等因素共同作用导致不同物种通过各自的TLR9 变异体识别不同微生物来源的 CpG，其中人和小鼠 TLR9 在氨基酸水平上只有76%的同源性，因此不难理解自然界存在种属特异的 CpG 基序及其识别机制。

最早研究发现 GACGTT 和AACGTT 等CpG 基序具有很强的小鼠特异性，但对人免疫细胞的活性较弱。即使如此，Dynavax 公司在乙肝预防性疫苗的III期临床研究中已证明含有AACGTT的CpG-1018具有良好的疫苗佐剂活性。然而这类序列用于人体临床的劣势在于所需剂量较大，每剂疫苗含有3 mg CpG-1018。

后来，Coley's 公司发现的GTCGTT 对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性，随后证明该序列对羊、马、猪、狗、兔等其他物种也有广泛免疫刺激活性。该序列的核心为人 CpG 基序 TCGT，因此对人免疫细胞具有很强的活性。Coley's 公司根据 GTCGTT 设计了 CpG-7909，在乙肝预防性疫苗的I/II期临床研究中证明每剂 0.125~1mg 的 CpG-7909 就具有良好的疫苗佐剂活性。相对于 CpG-1018，这类序列在临床应用中不但具有活性优势，还具有使用剂量低而更加经济安全的优点。

此外，研究表明，CpG效应细胞也具有种属特异性，在小鼠中为单核/巨噬细胞、树突状细胞和 B 细胞，在人体中为pDC和 B 细胞。CpG效应细胞的种属特异性提示动物模型研究结果并不一定能够在人体临床中得到重现。然而临床研究表明 CpG是一种良好的疫苗佐剂，虽然人常规树突状细胞不表达TLR9，但CpG激活的pDC 和B 细胞具有足够强大的抗原提呈能力；另一方面，CpG在小鼠中可激活单核/巨噬细胞诱生大量 TNF-α，从而产生严重毒副作用，而在人体中这些细胞并不表达TLR9，因此 CpG在人体中可能具有更好的安全性。

CpG疫苗佐剂的临床研究

自2000年以来，已有20种以上 CpG佐剂疫苗陆续进入临床研究。这些研究涉及传染病、肿瘤和过敏等疾病的预防性和治疗性疫苗，使用的疫苗抗原主要为重组蛋白和合成多肽，使用的CpG主要为B型，如CpG-1018。

第一个完成III期试验的含CpG的疫苗是针对乙型肝炎病毒的HEPLISAV。此前批准的HBV疫苗多是明矾佐剂疫苗，需要在6个月内进行三次免疫接种才能达到保护性抗体滴度。然而即使接种了完整系列的此种疫苗，仍有5-10%的免疫能力个体无法实现持久的血清保护。HEPLISAV中加入CpG可以改善针对HBV的体液和细胞介导的免疫反应的诱导。在III期临床试验中，与明矾佐剂疫苗相比，HEPLISAV以更少的免疫接种引发了更高的血清保护性抗体滴度。美国食品和药物管理局（FDA）于2017年批准其用于预防所有已知的HBV亚型引起的18岁以上成年人感染。

CpG作为佐剂的疟疾疫苗在美国、澳大利亚和马里进行了I期和IIa期试验。结果显示，CpG使志愿者对疟疾抗原产生了明显更强的免疫反应。与单独的抗原相比，CpG与抗原的结合使平均中和抗体滴度增加了六倍。这种增强的抗体反应是持续的：在接种疫苗后236天，加CpG免疫的人群血清抗体滴度比单抗原免疫的人群仍高4.6倍。

涉及CpG的临床试验数量最多的是在肿瘤学领域。一种主要的方法是将CpG与肿瘤相关抗原（TAAs）或肿瘤细胞结合。例如，在黑色素瘤患者的MART-1肽疫苗中添加CpG导致抗原特异性CD8+T细胞的频率增加10倍。在I/II期试验中，通过在MAGE-3疫苗中添加CpG，抗MAGE-3抗体滴度得到增强，其中一名患者产生了持久的客观反应。CpG也作为转移性肾细胞癌患者的疫苗佐剂进行研究。初步结果显示，用自体肿瘤细胞、CpG和GM-CSF接种疫苗，然后用IFN-α和CpG维持治疗，在七名患者中有三名病情部分缓解或稳定。

游离CpG诱导肿瘤特异性CTL的能力也在研究中。该概念涉及将CpG递送给接受过细胞毒性肿瘤治疗（包括放疗、化疗或使用单克隆抗体治疗）的患者。在这种条件下，CpG促进肿瘤细胞释放的肿瘤抗原的摄取，并改善随后的免疫反应。对恶性胶质瘤和淋巴瘤患者的初步研究支持TLR9激动剂可以协同增强传统的抗肿瘤策略的疗效。迄今为止，这种组合显示出良好的临床益处和安全性。

CpG的另一种给药方法涉及肿瘤内注射。该策略旨在激活癌症微环境中存在的DC，从而促进原位抗原的呈递。在进行的几项临床试验中， CpG在肿瘤内递送以治疗恶性皮肤肿瘤或淋巴瘤，这些试验产生了有希望的结果。这种策略在一半的基底细胞癌或黑色素瘤患者中诱导了肿瘤的完全或部分缓解，肿瘤内给予CpG（单独或与放射治疗联合）通过改善淋巴瘤和黑色素瘤病人中肿瘤特异性CD8+T细胞的产生，诱导了全身肿瘤消退。

安全性方面，CpG 佐剂会引起轻微至中度的副反应，包括注射位点疼痛、肿胀、硬结、红疹等局部反应以及流感样症状等系统症状，几天内会得到缓解，可能是由其免疫刺激特性导致的。

小结

在过去20-30年中，大量动物实验和临床研究证明 CpG是一种具有良好应用前景的新型人用疫苗佐剂。与现有疫苗佐剂相比，CpG的作用机制更为明确，具有更强的疫苗佐剂活性，尤其是细胞免疫佐剂活性。此外，CpG-ODNs 可通过化学合成大规模生产，易于质控，成本理想。随着对不同来源 CpG 佐剂的安全性、有效性研究的广泛、深入开展，研究数据的不断积累也将提升研究者与监管方对 CpG 的认知，CpG终将成为一种理想的新型人用疫苗佐剂。

参考文献：

1.Recent progress concerning CpG DNA and itsuse as a vaccine adjuvant. Expert Rev Vaccines.2014 Feb; 13(2): 299–312.

2. CpG-ODNs 疫苗佐剂的研究进展

3. CpG ODN 佐剂的研究进展及其药学研究的思考

       原文标题 : CpG疫苗佐剂的研究进展