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文章背景简介   

BACKGROUND INTRODUCTION

白细胞介素-6 (Interleukin-6，IL-6)由多种免疫类型细胞分泌，是一种能与IL-6受体结合的多效细胞因子，具有免疫调节、参与炎症反应等多种生物学功能。并且，IL-6具有显著的临床意义，在多种疾病或传染病，如脓毒症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、COVID-19患者体液中显著升高。此外，IL-6的表达失调可引起许多疾病或导致疾病恶化，如加重炎症病症，以及通过激活多种信号通路和增强抗凋亡蛋白的表达来加快癌症进展。IL-6作为信号通路已经研究了十多年，目前IL-6抑制剂已被证明可有效治疗慢性关节炎(JIA)、大动脉炎和巨细胞动脉炎(GCA)、细胞因子释放综合征(CRS)和其他严重疾病。

重链抗体(Heavy chain antibodies，HCAbs)最早由Raymond Hamers-Casterman教授在单峰骆驼中发现，它们仅由两条重链组成，既缺失了传统抗体的轻链结构，又缺少重链抗体恒定区VHH结构。重链中含有的一个可变抗原结合域(VHH)，称为纳米抗体(Nb )，其结构中含有的互补性决定区3(CDR3)环与框架2(FRW2)相互作用以保持Nb结构的稳定性。与天然抗体相比，Nb FRW2 中有四个亲水性标记(F37、E44、R45和G47)，增加了Nb的可溶性和单体表达。因Nb具有分子量小、亲和力高、溶解度高、稳定性好、渗透性强等特性，使其得到了广泛的应用。但在临床使用中，非人源化的Nb可能会导致强免疫原性。因此，纳米抗体人源化将是推进Nb应用的关键一步。

为了获得靶向抑制IL-6的人源化纳米抗体，华东理工大学的Lei Wang等人，开展了相关研究，并于2024年在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》期刊（IF=6.064；Q1区）发表了题为“Development of a synthetic library of humanized nanobodies for targeted IL-6 inhibition”的文章。

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所用到的主要方法

METHODS   

（1）计算机模拟与分析：用计算机预测和评估生物分子（如蛋白质、基因等）的性质和分析模拟过程的方法。

（2）圆二色光谱(CD)：应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。CD谱的noise.通过测量生物分子对左、右圆偏振光不同程度的吸收差异（称为圆二色性）来揭示分子的结构和构象信息。

（3）活体荧光成像

（4）流式细胞术

（5）重叠延伸PCR：是在PCR的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的新技术。

（6）ELISA

（7）共聚焦显微成像。

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文章主要内容摘要

ABSTRACT 

IL-6参与炎症扩增、肿瘤进展和许多其他疾病的发展。纳米抗体具有结构小、亲和力高的特点，在医学诊断和治疗中是一种功能强大、运用广泛的工具。本研究基于已优化的能够进行抗体人源化并提高稳定性的支架，开发了一种合成噬菌体展示文库，该文库可快速生成高亲和力和人源化的纳米抗体，无需动物免疫。以增强型绿色荧光蛋白( EGFP )为代表，证明该文库产生的人源化纳米抗体具有高功能和细胞内强稳定性。然后利用该文库进行抗IL-6的筛选，发现了一个突出的纳米抗体NbL3，它具有高亲和力( 22.16 nM )和强稳定性，并且在相对较低的浓度下显著抑制IL -6对人乳腺癌细胞MCF-7迁移的作用。NbL3 的强抑制活性为IL -6 靶向干预策略提供了一种有希望的治疗选择。

简而言之，本研究的主要内容有：

（1）分析了大量的纳米体-抗原复合物，确定了以纳米抗体Nb6B9为模板，再进行合理设计支架及随机化改变CDR区。

（2）通过圆二色性(CD)和HEK293T细胞的实时成像来表征纳米抗体体外和细胞内的稳定性。

（3）通过计算机模拟与分析，合成了涉及所需结构和序列多样性的引物，进行几次 PCR 循环，成功构建了有效库容量为3.7 ×109的人源化纳米体合成文库。

（4）使用EGFP对文库进行筛选,评估文库是否会产生特异性强和功能性高的EGFP结合物。

（5）利用文库鉴定并验证靶向IL-6的人源化纳米抗体，确定了纳米抗体NbL3可显著阻断了IL-6和IL-6R与MCF-7细胞的结合。

       原文标题 : 靶向抑制IL-6人源化纳米抗体文库的建立