Sanger双脱氧链终止法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。

一代测序结果图，横轴是电泳时间，纵轴是荧光强度，横轴也是碱基的先后次序。峰越高、越尖，与别的峰交错越少，则这个碱基判读准确性越好。结果肉眼可见，直观而准确。

二代测序：第二代DNA测序技术又称高通量测序技术（High－throughput sequencing， HTS），以低成本、较高的准确度，一次可对几百、几千个样本的几十万至几百万条DNA分子同时进行快速测序分析。这一时期的代表技术有 Roche公司的454（已退市）、Illumina公司的Solexa（已升级到Novaseq，市场份额第一）和ABI公司的SOLID（由ThermoFisher公司收购，已升级到Ion Torrent S5），由于该时期的测序技术十分前沿，因而市场主要被这三家公司所垄断。其测序技术复杂，生成测序文件数据量巨大，后续生物信息处理难度高，因此近5年才逐步进入临床，且多用于肿瘤精准用药的部分。

以illumina为例，我们简单介绍一下其测序流程。

①将目的DNA分子打断成100－200 bp的片段，随机连接到固相基质上，经过Bst聚合酶延伸和甲酸胺变性的桥PCR循环，生成大量的DNA簇（DNA cluster），每个DNA 簇中约有超过1000个相同序列的DNA片段。

②之后的反应与Sanger法类似，加入用4种不同荧光标记并结合了可逆终止剂的dNTP。固相基质上每个孔有八道独立检测的位点，所以一次可以并行八个独立文库，可容纳数百万的模版克隆，可把多个样品混合在一起检测，每个固相基质上一次可读取10亿个碱基。

③DNA簇与单链扩增产物的通用序列杂交，由于终止剂的作用，DNA聚合酶每次循环只延伸一个dNTP。每次延伸所产生的光信号被标准的微阵列光学检测系统分析测序，下一次循环中把终止剂和荧光标记基团裂解掉，然后继续延伸dNTP，实现了边合成边测序技术。

④其主要的缺点是由于光信号衰减和移相的原因使得序列读长较短，可以进行每个DNA测序片段的阅读长度较短，目前主流且成本最低的就是做双端测序150bp（PE150）。我们测全外显子组的策略也是PE150。

二代测序原理，通过簇生成，CCD捕获结合到模板的dNTP发的荧光，确定其DNA序列。

二代测序完成后，由于数据量巨大，复杂和多样，因此，结果是肉眼不可见的，需要专业的算法、流程将原始数据处理为可用的数据。可比喻为，测序只是去菜场买菜，算法则是把菜做成大餐的过程。这个过程需要超级计算机，建立好的优秀算法以及精通生物信息学分析的人员。

二代测序分析流程中，需要将原始测序数据进行质控后生成一系列的中间文件（左图），通过繁琐的生物信息学流程（中图），最后拼接成我们想要的基因。目前全流程多用Python和Perl语言在服务器上实现（右图）。

二代测序由于其原理的一些问题，导致必须同一个位点测多次，才能保证数据的可靠性。一般用于临床的数据，需要同一位点测序后出现200次以上。我们将这样的方案叫做测序深度（＞200 X）。二代测序的优势是巨大的，其数据量巨大，可短时间高效率对人类基因组测序，并发现大量未知位点。单个位点成本降低，是个性化医疗和精准用药的基础。

最后，还有一种类似测序的工具，叫做基因芯片。基因芯片的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法。目前由国内外几家大厂家所垄断。其优点是信息量较大，比一代测序的识别位点极大提升，可批量化生产并有完全标准流水线工作。但其缺点也很明显，成本仍较高，无技术门槛，只检测已选择好的位点，更新位点的时间和经费成本较高。比如illunima公司的ASA芯片，就是在一块芯片上集成了66万个人类基因组位点，检测信息量大约30m左右。

2001年，通过一代测序，耗资37亿美元，耗时13年，获得了人类基因组草图。到了2007年，用二代测序完成第一个完整的人类基因组序列图谱只花费了150万美元，耗时3个月。到了2020年，人类基因组测序只需要不到1万元人民币即可完成测序工作，时间只需要3天。近年来，测序技术突飞猛进，随着测序单价的不断降低，我们必将见证人人都有“基因身份证”的那一天。