最近的研究结果表明，通过TNF－R－SF传输信号的高阶六价途径更为优越。六价激动剂包含一个共刺激TNF－SF配体家族，这些配体特异性地结合靶细胞上的同源受体，并诱导六个受体链以空间上明确的方式聚集。特定化合物，如HERA－CD40L和MEDI5083（NCT03089645）是由三价的单链CD40L受体结合域（scCD40L－RBD）组成的融合蛋白，与人IgG连接，从而产生六价分子。

HERA－CD40L具有Fc沉默的IgG1，在缺乏FcγR介导的交联的情况下，可以有效地使CD40表达细胞的受体激活。用HERA－CD40L处理B细胞后，NFκB信号被强烈激活，单核细胞经HERA－CD40L处理后，促进了M1型的分化和M2型巨噬细胞向M1型的再极化。用HERA－CD40L处理T和B细胞体外共培养后，T细胞的抗肿瘤活性增强，这依赖于与B细胞的直接相互作用。在体内，小鼠HERA－CD40L替代物刺激抗原特异性T细胞克隆性扩增，并在CD40阴性同基因MC38－CEA小鼠结直肠癌模型中显示出单药抗肿瘤活性。

尽管重组CD40L是最早用于靶向CD40的技术之一，但这种方法的前景最近才显现。由于这些化合物是真正的激动剂，不需要FcγR介导的交联，因此与其他方法相比，它们应该具有更高的安全性。使用三价、四价和六价形式的新的分子正在探索。但正如我们所讨论的，通过TNF－R－SF的信号需要小心控制，太少的聚集导致没有信号，而太多的聚集则会导致过度刺激。

CD40激动抗体与基于CD40L方法的比较

虽然抗CD40抗体和基于CD40L的方法之间没有直接的临床比较，但有许多临床前的比较。关于小鼠需要注意的是，大多数小鼠研究使用的都是异种来源的抗CD40抗体。例如，克隆FGK45和3／23来源于大鼠，克隆HM40－3和1C10来源于仓鼠。这些同种异型对小鼠Fc受体亲和力的差异以及抗抗体使Fc受体结合在活性中作用的解释复杂化。使用全鼠抗体或在人源化小鼠模型中进行研究有助于阐明小鼠研究的结果。

诱导CD40信号：研究表明，具有独特表位的抗体在结合后会产生独特的生物活性。事实上，标记为激动剂或拮抗剂的抗体，其表位不同。二价抗体、三价CD40L，六价CD40L具有独特的诱导信号复合物的能力和生物学活性。用这些CD40靶向分子处理也产生了明显不同的生物学反应。例如，六价HERA－CD40L对活化、分化和抗原呈递标记物表达的影响通常强于三价CD40L或二价抗CD40抗体的刺激。重要的是，三价CD40L和抗体的弱活性主要依赖于交联。基于这些发现，可以认为抗体并不是合适的TNF－R－SF激动剂。相比之下，基于CD40L的方法，特别是可溶的六价CD40L分子能够通过一个确定的单一作用模式提供真正的激动信号。抗CD40抗体治疗的生物活性可归因于两种作用模式。首先，有限的激动剂活性，这是由FcγR介导的聚集产生的；其次，非激动剂依赖的活性，也取决于结合特定表位（表位驱动）和／或FcγR（Fc域驱动）。与基于FcγR结合缺陷的CD40L的方法相比，这些不需要的活性导致了显著的副作用。

与激动剂活性无关的副作用：不幸的是，激动剂抗CD40抗体治疗在临床上通常与毒性有关。在人类和小鼠中观察到一组常见的不良反应。例如，细胞因子释放综合征（CRS）可在治疗后数分钟至数小时内观察到，肝毒性在治疗后24小时内发生，并可持续数周。由于这些影响，已确定临床上系统给药抗CD40抗体的MTD，其范围为0．06至0．2mg／kg。这些影响可能与多种因素有关，包括血小板和内皮细胞表达CD40（和FcγR）以及抗体特异性特征。最近，关于抗CD40抗体的临床讨论已从毒性转为治疗指数（TI）。TI是一种药物安全性的相对定量测量方法，它将引起治疗效果的药物量与引起毒性的药物量进行比较。由于剂量限制性毒性，研发中的抗CD40抗体可能永远无法达到最佳治疗剂量。一种减少全身副作用的替代方法，即局部瘤内注射抗CD40抗体，已在许多临床前模型中显示出前景。在一项I期临床试验中，将静脉注射和瘤内注射抗CD40抗体进行比较，结果显示，在TI方面没有明显的总体差异；但是，与其他部位相比，某些肿瘤部位的瘤内给药与更有利的TI相关。这种治疗途径需要进一步研究，可能只适用于某些类型的肿瘤。

虽然表位位置和功能之间的关系仍有待确定，但很明显，一些抗体阻断了天然配体的结合，一些抗体增强了天然配体的结合，而其他抗体对结合没有影响。这些表位驱动的副作用可以阻止天然配体的活性，从而干扰抗肿瘤免疫反应。其他抗体可增强配体结合，从而有利于受体过度聚集和过度刺激免疫反应，增加毒性副作用和肿瘤特异性T细胞衰竭的风险。

FcγR表达细胞（包括吞噬细胞、粒细胞和一些淋巴细胞）的反向信号传导是Fc结构域驱动的副作用的原因。有趣的是，这些细胞群中有许多同时表达CD40和FcγR。FcγR介导的反馈信号的最关键结果之一是ADCC耗尽表达CD40的免疫细胞。这可能导致重要细胞群（包括单核细胞、树突状细胞和B细胞）的不必要消耗，从而影响有效的抗肿瘤反应。FcγR表达细胞群的激活也会导致免疫反应的过度刺激，并可能是抗CD40治疗后出现的CRS的原因。事实上，肝毒性与巨噬细胞依赖性细胞因子的产生有关，在小鼠模型中，抗CD40抗体介导的毒性可通过肝窦内表达FcγR的Kupffer细胞的耗竭而消除。

此外，CD40激动剂抗体的致死性肝毒性发生在化疗前，但可以通过逆转应用顺序来规避。这些发现表明，抗体为基础的方法与传统抗肿瘤治疗相结合可能存在问题。此外，由于抗CD40抗体治疗的毒性，许多小组正在试验替代给药途径，包括瘤内注射，这也可能使联合治疗复杂化。

靶向CD40的双特异性方法

双特异性CD40／靶标的概念包括许多不同的方法，例如结合CD40L等附加因子生成表达CAR的增强型CAR－T细胞（“细胞双特异性”），抗体识别顺式或反式两个不同的表位，甚至是一个靶向结构域和一个功能域结合在一个分子中的双特异性抗体。由于CD40的表达谱模糊不清，因此双特异性CD40激动剂的开发具有挑战性，尽管如此，已有人尝试使用CD40／间皮素双特异性结构（ABBV－428，NCT02955251），CD40／HER2双特异性结构和所谓的duokines。其它的CD40双特异性分子也在开发中，包括CEA和其他作为肿瘤靶向抗原。

与其它疗法的联合治疗

鉴于CD40的一般表达谱和生物活性，CD40激动剂与其他治疗方案的联合应用已在临床前模型中进行了研究。CD40靶向治疗与其他免疫调节剂或检查点抑制剂的使用在各种癌症模型中显示出巨大的潜力。例如，使用激动剂抗CD40抗体结合化疗或激酶抑制剂的临床前研究已显示出有良好的前景。

放疗（RT）是癌症治疗的支柱之一，在整个治疗过程中，高达70％的癌症患者接受放疗。RT的一个预期作用是释放肿瘤抗原并建立局部促炎的TME。因此，应用CD40激动剂来增强RT诱导的疫苗接种效果已经被集中研究，并在多个临床前模型中证明了其有效性。最终，TME的调节旨在激活并引导抗肿瘤细胞毒性T细胞，这一点可以通过PD－1、PD－L1或CTLA－4等免疫检查点抑制剂得到进一步支持。临床前模型中已描述了CD40抗体与检查点抑制剂的几种组合，尤其是抗PD－L1和CTLA－4抗体，最近在一项非对照I期试验中显示了一些临床活性的证据。

此外，在小鼠胶质瘤模型和其他指标中，结合肿瘤疫苗接种策略，已证明CD40信号具有治疗潜力，提高了过继细胞转移（ACT）治疗小鼠B16黑色素瘤模型的疗效。最后，除了前面提到的表达CD40L的CAR－T细胞外，还有一些证据表明，CAR－T细胞和抗CD40激动剂联合治疗可提高胰腺癌小鼠模型的抗肿瘤免疫反应。尽管这些初步结果令人鼓舞，但CD40靶向联合治疗的真正潜力，还必须经过恰当的随机对照临床研究的检验。

展望

增强抗肿瘤免疫应答的策略是肿瘤学最有希望的新进展之一，而TNF－R－SF成员，如CD40，是其中重要的靶点。由于产生高效TNF－R－SF信号的独特要求，激动剂分子必须产生非常精确的受体结构和三维结构。虽然已经探索了诱导CD40信号的各种策略，但是20年来有限的临床成功表明需要探索新的方法，这种信号通路激动剂的真正威力尚未在临床开发中充分释放出来。目前CD40激动剂临床疗效有限的原因归咎于抗体的结构和功能特性，包括每个分子只有两个靶结合位点，不适合刺激TNF－R－SF。由于这一信号通路具有广泛的靶向性，因此也可与其他药物和疗法联合应用。相信不久的将来会产生更多令人鼓舞的临床数据，提高治疗效果，并拓宽更多癌症患者的治疗选择。

参考文献：

Concepts for agonistic targeting of CD40 in immuno－oncology． Hum Vaccin Immunother． 2020；16（2）：377－387．