生物偶联技术

1． 基于化学的特异性原位抗体修饰

单克隆抗体的天然结构为生物偶联提供了多种可能性，基于化学的、特异性的天然（非工程）抗体偶联具有一些优点。它可以避免抗体特定位点突变的复杂性，以及在细胞培养的放大和优化方面可能面临的挑战。

偶联位点根据抗体序列，赖氨酸、组氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等内源性氨基酸在二硫键间的连接位点非常具有吸引力。所有经FDA批准的ADC，直到2021年，都利用这些内源性氨基酸进行偶联。然而，抗体支架还包含聚糖，这是在单克隆抗体生产过程中，FC区域的翻译后修饰所导致的。一些研究报告了糖工程化的新策略，这似乎是一种有趣的生物偶联替代方法。

与内源性氨基酸的偶联

最常见的偶联方法之一是利用抗体的赖氨酸残基，氨基酸亲核NH2基团与利克有效载荷上亲电的N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）基团发生反应。尽管反应简单，但可利用赖氨酸残基的高丰度导致了许多ADC在随机分布下的不均匀混合物的形成。DAR受药物／抗体化学计量比的控制，该方法得到广泛应用，包括已获批的ADC，如Besponsa， Mylotarg， 和Kadcyla。

最近，同样也报道了对赖氨酸位点和残基的特异性修饰。通过计算机辅助设计，磺酰丙烯酸酯被用作中间试剂，用于在天然蛋白质序列上对单个赖氨酸残基进行修饰。

反应的区域选择性归咎于磺酰丙烯酸酯的设计以及每个赖氨酸周围独特的局部微环境。通过计算预测，pKa最低的赖氨酸容易以位点特异性的方式在弱碱性pH下优先反应。即使在其他亲核残基如半胱氨酸存在的情况下也观察到了这种反应。该技术已应用于5种不同的蛋白质和曲妥珠单抗，在偶联后均保留了原有的二级结构和蛋白质功能。

2018年，Rai等人报告了另一种利用“化学关键蛋白”的可逆分子间反应进行的位点特异性修饰。该试剂携带多种官能团，这些官能团在所有可获得的赖氨酸残基上可逆地形成亚胺部分。然后，关键蛋白通过试剂中的环氧化物与近端组氨酸残基反应。因此，在生理条件下，关键蛋白从赖氨酸中分离，醛被再生，从而能够通过肟结合标记抗体。

这种关键蛋白的定向修饰技术后来发展成单赖氨酸残基标记技术，即使在存在N－末端胺的情况下也具有毋庸置疑的选择性。方法的成功依赖于Fk1－间隔子－Fk2试剂。

Fk1官能团与赖氨酸可逆反应，调节Fk2近端赖氨酸部分的微环境。然后通过酰胺键在Fk2处的赖氨酸残基（K169和K395）进行偶联，间隔子的设计调节偶联的位置。该方法已成功应用于ADC（trastuzumab－emtansine）的合成，证明其细胞活性与已获批准的Kadcyla相当。

Merlul等人最近报道了一种不同的结合策略，有效地靶向天然抗体上的组氨酸残基。他们引入了一种基于阳离子有机金属铂（II）的连接子，［乙二胺铂（II）］2＋，图中表示为Lx。

这种技术基于络合和偶联两个步骤。氮杂环配体如哌啶与Lx配位形成络合物前体，稳定的中间体包含有效载荷和配体上的一个氯离子。该复合物含有带正电荷的Pt（II）中心，这提高了连接子和有效载荷复合物的水溶性并最小化抗体聚集，该方法还扩展到类似的碘络合物。在最近的一份报告中，碘化钠的使用被证明可以显著提高该技术的偶联产率和选择性。Cl－Lx－药物载荷络合物上残留的氯配基与碘化物的交换生成更具活性的I－Lx－药物载荷，从而获得更高的偶联产率。这项技术已被应用于ADC药物的大规模生产。

二硫化物重桥接策略

IgG抗体包含四个链间二硫键，两个连接轻链和重链，两个位于连接两条重链的铰链区，它们维持着单克隆抗体的完整性。另一个经典的生物偶联途径探索了这些半胱氨酸作为有效载荷连接点的作用。四个二硫键的还原通常会产生八个巯基，它们能够与马来酰亚胺的连接子反应，从而产生DAR为8的ADC。

Doronina及其同事报告了嵌合抗CD30单克隆抗体偶联MMAE，DAR＝8的 ADC实例。与经典的赖氨酸偶联相比，这种有效载荷加载方式得到了更好的控制。然而，据报道，较高的药物负荷会增加聚集的风险，从而导致高血浆清除率，并降低体内疗效。

Badescu和al在2014年报告了一种新的位点特异性重桥接偶联策略，他们是第一个证明新的双砜（bis－sulfone）能够烷基化来自抗体和抗体片段中还原二硫键的两个巯基，对抗原结合的影响最小。后来，Wang和al描述了一种新的水溶性烯丙砜（allyl sulfone），该试剂在没有原位活化的情况下提高了反应活性。它表现出高稳定性、高水溶性和位点特异性。

此外，还有巯基炔与末端炔烃和环辛炔生物偶联的再桥接技术，其进一步发展出新一代马来酰亚胺，如二溴－（DBM）和二硫代马来酰亚胺（DTM），用于位点特异性偶联。这些马来酰亚胺类似物在第3位和第4位含有良好的脱离基团，从而实现快速、高效和高产率的偶联。最近报道了结合二溴和二硫代马来酰亚胺性质的杂化硫代溴马来酰亚胺（TBM），这种TBM试剂结合更快，显示出更高的DAR＝4的百分比，这可能是由于溴减少了空间位阻。

2015年，Chudasama等人引入了一类新的重桥接试剂，二溴吡啶二酮（dibromopyridazinediones）。他们证明了它能有效地插入到二硫键中，得到的结构即使在高温下也表现出了极好的水解稳定性。然而，随着还原步骤上的温度升高，也观察到不均一性，这种结构也允许选择性地引入不同的功能基团。

二乙烯基嘧啶（Divinylpyrimidine）是另一种有效的重桥接试剂，能够产生稳定的DAR＝4的ADC。Spring等人研究了乙烯基杂芳基支架对半胱氨酸再桥接的作用，他们认为用嘧啶取代吡啶可以使杂芳环成为更好的电子受体，从而提高交联效率。他们的工作扩展到二乙烯基三嗪，在高温下，重桥接显示出更高的效率。

为了避免与经典马来酰亚胺偶联相关的体内不稳定性的缺点，Barbas等人研究了甲基磺酰基苯基恶二唑，该试剂对半胱氨酸具有特异性反应。与血浆中的半胱氨酸－马来酰亚胺偶联物相比，他们的稳定性更高。受此启发，Zeglis设计了DiPODS试剂，该试剂含有两个通过苯基连接的恶二唑基甲基砜部分， DiPODS以重桥接的方式与两个硫酸根形成共价键。与马来酰亚胺偶联相比，以这种方式偶联具有优越的体外稳定性和体内性能。

聚糖偶联

由于IgG是一种糖蛋白，它在Fc片段每个重链的CH2结构域N297位置包含一个N－聚糖，这种糖基化可以作为连接有效载荷的附着点。多糖与Fab区域间远距离定位降低了在偶联后损害抗体的抗原结合能力的风险，此外，与抗体的肽链相比，它们的化学组成不同，允许位点特异性修饰，使它们成为合适的偶联位点。

聚糖生物偶联可根据用于靶向碳水化合物的技术来区分：包括聚糖代谢工程化、聚糖氧化后的糖转移酶处理、内糖苷酶和转移酶处理后的酮或叠氮化物标记。

Neri等人报道了在IgG抗体的N－糖基化位点处岩藻糖的位点特异性修饰。这种糖含有一个顺式二醇部分，适合选择性氧化。他们用偏高碘酸钠氧化岩藻糖残基，生成一个能够与含联氨的连接子反应的醛基，这样，抗体通过腙键与药物相连。

Senter及其同事向细胞培养基中添加硫基类似物，通过代谢将6－硫代岩藻糖带入抗体修饰。他们认为，取代是通过劫持岩藻糖基化途径来完成的，这样就引入了化学位点来实现位点特异性结合。与经典半胱氨酸偶联物相比，这种方法显著降低了异质性水平，并产生具有更可预测的药动学和药效学特性的偶联物。

重组IgG中很少含有唾液酸，然而，已经证明，利用半乳糖基和唾液酸转移酶可以酶法改造甘氨酸。通过酶反应添加半乳糖以获得G2聚糖，然后添加末端唾液酸。这种修饰通过高碘酸氧化生成醛基，可以偶联带羟胺基团的连接子－有效载荷。所得的偶联物具有较高的靶向选择性，体内抗肿瘤活性良好。高碘酸还可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸，影响与FcRn的结合。

除这些偶联策略外，半乳糖残基也可以作为修饰位点。多项研究报告了通过使用突变的β－ 1，4－半乳糖转移酶，将半乳糖替换为一种含酮或叠氮官能团的半乳糖，这种具有双正交官能团的半乳糖衍生物为高效偶联开辟了途径。这些技术已被开发用于成像和抗癌应用。

从化脓性链球菌中发现的内糖苷酶EndoS和EndoS2，这些酶能够水解IgG的N－聚糖，从而使水解后的残基成为生物偶联的有效位点。这种方法有助于使单抗的聚糖结构均匀化，同时它也适用于任何IgG亚型。此类方法应用于trastuzumab－maytansine，制备出具有良好体外和体内药效的糖偶联ADC。

2． 工程化抗体的位点特异性生物偶联

生物正交化学和蛋白质工程领域的进展有助于产生更均匀的ADC。尽管在天然单抗上有许多可用的附着方法可供选择，但在工程化抗体上的位点特异性生物偶联能够更有效地控制DAR，并且避免改变与抗原结合的亲和力。这样，在某些位置加入天然或非天然氨基酸，得到具有优良药代动力学和药效学特征的同质产品。

酶法

有效载荷的附着可以通过在抗体序列中插入特定的氨基酸标签以非常有选择性的方式实现。这些标签被特定的酶所识别，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG）、转肽酶或酪氨酸酶，从而能够执行位点特异性偶联。

Aaron等人探索了一种新的利用醛标记蛋白质的位点特异性偶联。该技术利用了基因编码的五肽序列（Cys－X－Pro－X－Arg），其中半胱氨酸残基被FGE识别，并在细胞中蛋白质表达期间被共翻译氧化为甲酰甘氨酸。这样，工程化抗体通过HIPS（hydrazino－Pictet–Spengler）化学方法与醛特异性连接子选择性偶联。

微生物转谷氨酰胺酶（MTGase）策略也经常被开发用于定位特异性偶联。MTGase催化在脱糖抗体295位置的谷氨酰胺侧链与底物的伯胺之间形成肽键。与其他酶策略相比，MTG是一种灵活的技术，不需要肽供体来实现偶联。只要酰基受体含有一种伯胺，就没有结构限制。

谷氨酰胺残基自然存在于单抗的每个重链的Fc区域。在295位去糖基化后，谷氨酰胺残基通过MTGase介导的反应偶联，可以产生均一的DAR＝2的ADC。为了提高效率，可以偶联带支链的连接子，从而使DAR翻倍，297位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺也可增加DAR。

NBE Therapeutics开发了基于S金黄色葡萄球菌转肽酶A介导的偶联。他们的策略利用转肽酶A（SrtA），在LPXTG（X＝任何氨基酸）五肽的基序中切割苏氨酸和甘氨酸残基之间的酰胺键。然后，它催化甘氨酸相关的有效载荷与新生成的C－末端的偶联，在生理温度和pH下生成肽键。

该方法应用于不同抗体，如抗CD30和抗Her2，并使用含有5甘氨酸标记的连接子偶联maytansine和MMAE，两种ADC均显示出与经典偶联相似的体外细胞杀伤活性。酶法产生的trastuzumab－maytansine在体内试验中完全匹配Kadcyla。

在另一个例子中，利用转肽酶法生成了高效蒽环素毒素衍生物PNU－159682的ADC。有趣的是，通过这项技术，偶联效率甚至高于Adcetris和Kadcyla类似物。此外，所制备的PNU－159682 ADC具有较高的体外和体内稳定性，并且显示出的效力超过了含有微管蛋白靶向有效载荷的ADC。

另一个新兴的新方法是通过酪氨酸标签进行位点特异性抗体标记，酪氨酸标签与单克隆抗体轻链的C末端基因融合。考虑到位点可及性，Bruins及其同事使用了一种工程化的四甘氨酰酪氨酸残基作为标记，它为偶联提供了一个容易触及的位点。酪氨酸酶将酪氨酸氧化成1，2－醌，从而允许与各种双环［6．1．0］壬炔（BCN）衍生物的环加成反应。这种方法可以与含有BCN连接子的MMAE有效地偶联。

半胱氨酸工程：硫单抗技术

随机半胱氨酸偶联和重桥接是利用抗体结构内天然存在的半胱氨酸残基的技术。然而，随机半胱氨酸方法的异质性以及重桥接策略中的单抗片段化需要在ADC合成中加以考虑，特别是当疏水性药物被偶联时。

与它们不同的是，硫单抗技术通过利用不涉及结构二硫键的工程化反应性半胱氨酸，在抗体上实现所需位点的选择性和均匀修饰。一般来说，半胱氨酸突变的设计是为了促进细胞毒性有效载荷偶联的同时，保持单克隆抗体的稳定性、亲和力和最小化ADC聚集。为了确定突变的最佳位置，通常采用几种技术，包括计算建模、模型系统筛选和高通量扫描。

Junutula等人首先报道了一种硫单抗策略，用工程化半胱氨酸残基取代了抗MUC16抗体重链114位的丙氨酸（HC－A114），工程化位置内的反应性硫醇能够与马来酰亚胺负载的连接子反应。合成的抗MUC16 ADC在异种移植小鼠模型中表现出效力，在大鼠和食蟹猴中表现出高剂量耐受性，这个发现建立了硫单抗偶联策略的一般性方法。

此外，琥珀酰亚胺连接在胞浆内可以经历两个平行反应：反向Michael反应导致连接子－有效载荷的损失，以及琥珀酰亚胺的水解，这两种反应都对体内ADC活性有显著影响。为了提高稳定性，Lyon和合作者设计了一个与马来酰亚胺相邻的碱性氨基整合进来的连接子。在连接子中加入二氨基丙酸（DPR）促进了硫琥珀酰亚胺在中性pH和室温下的快速定量水解，这样，非特异性的去偶联作用被阻止，从而提高了体内的稳定性。除了常用的马来酰亚胺外，还探索了不同的半胱氨酸反应剂，如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯，N－烷基乙烯基吡啶盐。

3． 与工程化非天然氨基酸的生物偶联

除了硫单抗技术外，非标准氨基酸（ncAA）的加入为位点特异性偶联提供了另一种可能性。该技术使用含有独特化学结构的氨基酸，从而能够以化学选择性的方式引入连接子－有效载荷复合物。该技术需要对抗体序列重组，利用与宿主细胞内所有内源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于响应未赋值密码子将ncAA带入蛋白质。通常，ncAA在发酵过程中被添加到培养基中。选择非天然氨基酸是很重要的，因为它们可能激发免疫原性。常用的ncAA是具有独特基团的天然氨基酸的类似物，如酮、叠氮、环丙烯或二烯。

已有研究将对乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗体中。有效载荷Auristin通过肟连接与抗体有效偶联，从而生成化学均一的ADC。该ADC在小鼠体内表现出良好的体外活性和完全清除肺肿瘤的作用。

由于肟连接所需的酸性条件和ADC缓慢释放的动力学，另一种选择是加入含ncAA的叠氮化物。广泛应用的对叠氮哌苯胺（pAzF）可在生理条件下快速进行CuAAC或SPAAC反应，利用这种策略成功地在抗CD74抗体上偶联糖皮质激素有效载荷。除了pAcF技术外，还成功地将含叠氮的赖氨酸类似物（AzK）带入到抗体中，以产生具有Auristin、PBD二聚体或微管蛋白有效载荷的位点特异性ADC。

此外，赖氨酸的环丙烯衍生物（CypK）以及自然发生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合进入抗体中。所产生的ADC表现出良好的稳定性、选择性以及体外和体内活性。

ADC的相关内吞途径

一般来说，正常的内吞作用可分为三个阶段：（1）芽的形成，（2）膜的弯曲和囊泡的成熟，（3）膜的断裂并释放到细胞质中。多种内吞途径有重叠的方面，因此内吞的一般过程是高度灵活和复杂的。

网格蛋白介导的内吞作用

网格蛋白介导的内吞作用（CME）在概念上是一个简单的过程，包括几个连续和部分重叠的步骤。CME可由质膜上的某些受体结构性启动，或者需要配体和／或抗体结合后启动。当细胞质中的内吞衣壳蛋白开始聚集在质膜的内小叶上时，CME就开始了。衣壳蛋白通过从细胞质中招募并与额外的蛋白质适配器相互作用而继续组装和生长。关键的衔接蛋白使膜弯曲，从而将内化受体／配体集中到一个“网格蛋白包被坑”（CCP）中。由于CCP内陷增大，CCP颈缩窄时，通过一个断裂过程与质膜分离。肌动蛋白聚合有助于将CCP向内拉入细胞质，直到断裂完成，CCP释放并成为一个网格蛋白包被的囊泡（CCV）。最后，CCV外壳被分解，CCV与内涵体融合以运输到特定的亚细胞位置，或者可以被回收回细胞表面。  

网格蛋白是CME的关键成分，由重链和轻链组成。三个网格蛋白重链和轻链形成一个三聚体，它与其他三聚体相互作用，并在新兴的CCP周围形成一个多边形晶格。衔接蛋白2（AP－2）是一种异源四聚体复合物，它介导CCP颈部的收缩。Dynamin是一种GTP酶，在成熟囊泡的颈部形成螺旋状聚合物。GTP水解后，dynamin诱导囊泡从质膜分裂。

小窝介导的内吞作用

不依赖于网格蛋白的内吞作用包括小窝介导的内吞作用、小窝蛋白非依赖性载体蛋白／GPI－富集的早期内区室（CLIC／GEEC）和巨胞饮作用。

小窝是质膜的小瓶状内陷，其特征是高水平的胆固醇和鞘糖脂，通过不依赖于网格蛋白的途径介导内吞作用，并且存在于大多数细胞类型中。小窝的主要支架蛋白是小窝蛋白，它是形成寡聚体的20–24 kDa完整膜蛋白。小窝蛋白共享共同的支架结构域，这些支架结构域介导与自身和其他包含小窝蛋白结合结构域蛋白质的相互作用。

虽然小窝具有类似CCPs的内陷形态，但它们是不同的。简单地说，CCP的密度是恒定的，而小窝的密度会因细胞类型的不同而变化很大。CCPs随着萌发的内体成熟而增大，相比之下，小窝囊泡保持不变的大小。一旦进入细胞内，小窝就形成了高阶结构，而不是由CCPs形成的简单的球形内体。

小窝蛋白介导的内吞作用的另一个独特方面是，只有约1％的小窝是从质膜上萌发的。在一小部分内化的小窝中，它似乎遵循一条与Rab5（早期内胚体的标志物）共定位的循环途径。这可能对以利用小窝蛋白介导内吞作用的受体为靶点的ADC带来挑战。

CLIC／GEEC内吞作用

CLIC／GEEC是一种内吞室，主要发生在配体激活的细胞中，这可能由生长因子、抗体的受体交联或细菌毒素和病毒引起。此外，细胞膜必须处于高流动性状态，因为CLIC／GEEC在低于生理温度或膜处于更高张力的情况下不起作用。

CLIC在迁移细胞的前缘增加。识别CLIC／GEEC途径的其他相关参数包括动力非依赖性质膜断裂、对胆固醇消耗的敏感性、Rab5／与早期内体融合的获得、胎盘碱性磷酸酶（PLAP）和与FAK相关的GTPase调节因子（GRAF1）。

巨胞饮作用

巨胞饮作用是一种更大规模的内吞作用形式，通常涉及质膜高度皱折的区域／突起，这些区域／突起随后相互融合或与质膜融合。膜皱褶是巨胞饮作用的形态学特征。

巨胞饮作用依赖于肌动蛋白聚合、Rac1蛋白和p21活化激酶1（PAK1）。PAK1是一个关键的调节因子，因为它与Rac1相互作用，Rac1激活磷脂酰肌醇－3－激酶（PI3K）、Ras、Src和Hsp90，以促进巨胞饮作用。巨胞饮作用也是胆固醇依赖性的，这是招募Rac1所必需的。这些成分最终导致比CME和小窝蛋白更大吸收面积的内吞作用。

ADC靶向抗原的内吞特性

CD33

CD33是一种67kda跨膜糖蛋白受体，通常在正常髓系细胞上表达，由于其在AML细胞上优先过表达，是GO的靶点。CD33的胞内免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）调节CD33的内吞作用，可通过CME激活内吞作用。关于内吞效率，AML细胞中CD33的表达水平与其内吞率之间没有相关性。CD33是一种缓慢内化的抗原，此外，CD33交联并不能改善内吞作用。对GO无响应的AML患者可能与CD33受体内吞的功能低下有关。

CD30

CD30是一种120kda跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族。其细胞外部分由六个扩展构象的富含半胱氨酸的结构域（CRD）组成。CD30在活化的T细胞和B细胞以及各种淋巴肿瘤（包括霍奇金淋巴瘤和ALCL）上表达。

CD30不具有内吞作用，相反，它因蛋白水解裂解而脱落，CD30的脱落由基质金属蛋白酶（MMPs）介导。脱落是CD30生物学的一个特征，高浓度的循环可溶性CD30可以作为监测肿瘤进展的血清标志物。对于ADC的疗效，升高的CD30循环水平似乎会隔离注射的ADC，从而减少能够定位于CD30阳性肿瘤部位的ADC的数量。因此，缺乏内吞作用的结果表明CD30不是理想的ADC靶点。

CD22

CD22是一种140 kDa的跨膜糖蛋白，与CD33一样，它也是Siglec家族的成员，并与该家族共享多种结构特征。关键的区别在于CD22比CD33大得多，因为它有多个Ig结构域和ITIM／ITIM样基序。CD22的表达仅限于B细胞，CD22在各种B细胞恶性肿瘤（包括ALL）的大多数母细胞中表达水平升高。

CD22通过CME进行内吞作用。类天然配体通过CD22的结构性快速内吞在细胞内积聚。这些配体在溶酶体中被分类降解，而CD22则循环回到细胞表面。此外，CD22配体诱导的内吞激活细胞内池，补充或增加细胞表面CD22的表达水平。因此，CD22对ADC具有良好的内吞特性。

CD79b

CD79b仅在未成熟和成熟的B细胞中表达，在恶性肿瘤≥80％的B细胞中过表达。CD79a和CD79b是两种非共价结合的跨膜蛋白，介导信号传导和内吞作用。对于后者，CD79a－CD79b异二聚体是控制BCR内吞的支架。BCR内吞作用主要由CME完成，并由AP－2介导。有趣的是，CD79a直接与AP－2的μ亚单位相互作用，进而激活CD79b并导致整个BCR复合物的内吞。

此外，对于ADC来说，CD79a可以作为单体内化，但CD79b却不能。如果CD79b的近端膜酪氨酸（Y195）发生突变，AP－2与CD79a的结合就会被阻断，内吞也被阻断。在18％的活化B细胞样DLBCL标本中，Y195发生突变。总之，有证据表明CD79b其内吞活性依赖于整个BCR复合体的内化，而不是作为单体的内化。

TROP－2

Trop2是一种46kDa的单体糖蛋白，具有选择性过度表达、结构性内吞作用和导向溶酶体等特性，使其成为ADC的一个非常有吸引力的靶点。Trop2的内化机制与CME有关。

观察到的Trop2强大的内吞作用，一种潜在的解释可能是由于显著的Trop2聚集。研究Trop2的构象动力学，发现Trop2通过位于跨膜结构域的氨基酸“VVVVV”组成的相互作用片段形成天然的同型二聚体。Trop2的二聚作用可以通过其他细胞表面蛋白质进一步将Trop2单体招募到更接近的位置。因此，Trop2簇很可能由多个二聚体通过脂筏和其他膜结合蛋白连接而成。

Trop2与多种配体结合，如claudin－1、claudin－7、cyclin D1和IGF1，然而，这些配体都没有证明在与Trop2结合或相互作用时被内化。因此，与正常细胞相比，Trop2在肿瘤细胞中发生的内吞作用更为强烈，这些都表明Trop2是ADC的一个很好的靶点。

BCMA

BCMA或CD269，也称为TNFR超家族成员17，转导诱导B细胞存活和增殖的信号。BCMA的分子量仅为20．2 kDa，其配体结合的胞外区域具有“臂椅”构象，由六个CRD组成。除了多发性骨髓瘤外，BCMA还表达于许多血液系统恶性肿瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

然而，关于BCMA所利用的精确内吞途径的知之甚少。与内吞作用有关，唾液酸化是一种调节功能，它可能诱导BCMA利用CME发生内吞作用。

HER2

HER2是一种185kda跨膜糖蛋白，属于EGFR家族。HER2／neu基因的扩增是已知的人类恶性肿瘤和转移的驱动因素。由于HER2在癌症中的作用，几十年来一直被作为治疗靶点。HER2也一直是ADCs的靶点，T－DM1和T－DXT都被批准用于HER2阳性转移性乳腺癌患者。

HER2的内吞存在多种机制，首先是CME，共免疫沉淀清楚的显示HER2直接与AP－2结合，此外，dynasore能完全阻断SKBR3细胞的HER2内吞作用；其次小窝蛋白结合基序φxφxxxxφ（φ代表芳香族氨基酸Trp、Phe或Tyr）通常存在于小窝蛋白相关蛋白上，有趣的是，序列WSYGVTIW已在HER2的细胞内激酶结构域中被鉴定出；另外，有研究证明HER2可以利用CLIC／GEEC的内吞途径。

这些不同的发现揭示了HER2内吞的重要特征。首先，HER2的内吞作用是混杂的，其次，小窝介导的内吞途径似乎更常被利用。

Nectin－4

Nectin－4是一种66 kDa 的I型跨膜蛋白，其主要作用是促进细胞间的接触。Nectin－4作为ADC靶点很有吸引力，因为研究表明，它在几种肿瘤类型中过表达，但在正常成人组织中几乎不存在。

目前，没有发现天然配体或mAb／ADC与nectin－4的复合物内吞的信息，但是可以借鉴nectin－4结合病原体内吞的研究。Nectin－4也是麻疹病毒的受体，研究表明，麻疹病毒通过巨胞饮作用进入MCF7、HTB－20乳腺癌和DLD－1结直肠癌细胞。病毒进入需要PAK1，相反，dynamin抑制剂Dynasore对病毒进入没有影响。此外，表达显性负性小窝蛋白的细胞并不能消除病毒的内吞作用。

基于这些间接研究，nectin－4表现出病毒受体所需的强大的内吞活性。

ADC的药代动力学

药代动力学是临床药理学和现代药物开发过程中不可缺少的一部分。应该认识到，与小分子和治疗蛋白（抗体或融合蛋白）不同，ADC的PK非常复杂，因为ADC由几个组成部分组成。不仅要考虑单抗的PK，还要考虑细胞毒性分子的PK以及结合的物化性质。由于单抗的分子量占到了90％以上，因此ADC的不同组分的PK受其PK的影响很大。总抗（ADC＋mAb）的PK特征提供了ADC稳定性和完整性的最佳评估。偶联物和偶联位点在维持ADCs的稳定性和PK中也起着重要作用。下表列出了FDA批准的ADC及其PK的特性。

一般来说，AD在给药后，体内涉及四个过程。这些过程是吸收、分布、代谢和清除。大多数抗体通常通过静脉注射或输液途径给予，抗体也可以通过皮下（SC）途径给予。然而，对于ADC，目前给药途径是静脉注射或输液。由于对细胞毒性有效载荷的反应和细胞毒性物质的局部沉积，SC给药可能不适用于ADC。

药物在体内的分布可以用分布容积来描述。由于其大小和极性，抗体和ADC的分布通常局限于血管和间质间隙。ADCs的初始分布一般局限于血管，其分布容积一般等于血容量。随后，ADCs可以分布到间质间隙。此外，ADC分布也会受到靶抗原表达和内吞的影响。ADC在同一组织中的分布和积累会产生不良的（毒性）药理学影响，这是由于ADC的摄取后的细胞毒性药物或代谢物的释放。

ADC体内分解／代谢过程包括抗体分解代谢过程和小分子药物体内代谢。ADCs在到达肿瘤细胞前，在细胞内（non－cleavable linker）或者循环系统中（cleavable linker）释放效应分子，未结合的抗体和抗体片段遵循抗体的代谢途径通过酶解产生氨基酸，被机体重新利用。

ADC裂解或被分解代谢后可能形成的游离的小分子药物和／或连有氨基酸残基的小分子药物和／或linker的小分子药物代谢物，会进一步经历肝CYP450酶代谢，还可能发生潜在的药物药物相互作用。除了ADC本身性质外，抗原的表达、受体／细胞密度，FcRn介导的循环作用、与Fcγ作用、受体介导的内吞作用、免疫原性等都会影响ADC的分解代谢。

ADC也是通过分解代谢和排泄的方式进行消除。ADC可通过与靶点结合的特异途径，进入溶酶体后发生降解，释放小分子药物后从体内清除；还可以通过非特异的胞饮作用进行清除，该途径涉及新生儿受体（FcRn）参与的循环再利用过程。

ADC、抗体、分子量较大的多肽及氨基酸片段无法通过肾小球滤过排泄，而是以氨基酸的形式重新吸收利用。游离小分子药物、分子量较小的多肽及氨基酸连接的小分子药物、分子量较小的抗体片段可通过肾小球滤过进行排泄。同时，小分子药物及代谢产物也可经酶代谢消除或通过转运体排泄至粪便中。

ADC的免疫原性

在针对8个ADC的11个临床试验中， ADAs的基线发生率在1．4％到8．1％之间，基线后ADAs的发生率在0－35．8％之间，这些数值在治疗性单克隆抗体的范围内。总的来说，ADCs的ADA发生率在靶向血液肿瘤的患者比靶向实体肿瘤的患者少；大多数ADA是针对ADC的单克隆抗体结构域的。此外，在大多数患者中，这些ADC的半抗原样结构并不比治疗性单克隆抗体产生更多的免疫应答风险。

ADC的临床开发概况

目前，ADC药物开发领域持续火热，有效载荷，连接子和偶联技术的快速发展使ADC具有更高的均匀性、稳定性和生成效率。这为临床上的ADC药物开发提供了燃料，下面3个表格按照“小分子、生物大分子和放射性同位素”的分类总结了截至2021年2月处于临床开发后期中的ADC。

小结

尽管第一个ADC在20多年前就获得了FDA的首次批准，但制药行业必须经历一个漫长且乏味的学习过程，才能在市场和临床开发中获得一条稳定的ADC管线。尽管目前已有13种已批准的ADC，但是由于ADC的技术进步，该领域正在经历一次爆发，我们在有效载荷，连接子和偶联技术方面获得了多个突破，进一步加深了对ADC这种新型药物的全面认识。

此外，药物剂量－暴露－效应关系的确定是ADC成功的关键，内吞作用是这种关系的关键部分，对于优化给药方案以最大限度地提高治疗指数非常重要。然而尽管目前ADC领域如火如荼，但是我们对靶受体的内吞作用仍知之甚少。另外，许多内吞作用的核心成分和关键的效应器非常重要，然而这些蛋白可能在癌症中普遍发生突变，这也会影响ADC内吞作用和疗效。相信随着该领域的发展，经过无数次积累的经验，ADC终会迎来真正的春天。

参考文献：

1．The Chemistry Behind ADCs． Pharmaceuticals （Basel）． 2021 May； 14（5）： 442．

       原文标题 : 通往ADC的成功之路：全面认识ADC