大家好,今天菠萝冰给大家分享一篇22+分的学习笔记。

题目:病毒驱动型和致癌物驱动突变型头颈癌的免疫状况。

一、 分析思路

我们给?家简单解读?下分析思路:本篇学习笔记中通过单细胞RNA测序分析和多光谱免疫荧光(IF)比较了突变驱动型和病毒驱动型(HPV+)头颈部鳞状细胞癌HNSCC的免疫状况,并研究了肿瘤中的空间定位模式和微环境(TME)中细胞邻近关系。为HPV +和HPV-HNSCC中的免疫谱系,细胞的转录状态和分化轨迹以及与肿瘤进展潜在相关的细胞交互提供了深入了解。最后,还确定了在临床中具有预后潜力的基因集。

二、 结果解读

1．HNSCC免疫谱系的单细胞研究

首先,测序完成得到基因/barcode矩阵后,经过质量控制,一共评估了HPV–和HPV + HNSCC患者以及健康供体的外周和肿瘤内免疫细胞中131,224个单细胞的转录谱。

实验组:术后未接受免疫治疗的HPV–患者(n=18)、HPV + HNSCC患者(n=8)的原发肿瘤中成对血液和组织来源的所有活细胞(即CD45 +PBMC、CD45 +TIL)(图1A);对照组:健康供体的外周血单核细胞(n=6)、健康供体的扁桃体组织(tonsil,n=5)。

接着,根据单细胞数据进行伪bulk分析(Pseudobulk analysis),即通过计算细胞的基因总计数,生成每个样本的伪表达谱,以形成每个患者的表达矩阵。鉴定出PBMC,TIL和tonsil之间的差异表达基因后,使用R包heatmap3可视化得到样本间相关性,结果发现相较正常和肿瘤PBMC,组织层面的TIL和tonsil的差异更大,所以接下来聚焦于比较TIL和tonsil。鉴定出TIL和tonsil之间差异表达基因后,还进行了事后功效分析(post hoc power analysis)评估现有研究的统计能力,发现需要9名患者才能有80%的能力找到两者的差异表达的基因。

在进行文库大小归一化,控制线粒体和核糖体基因,对高度变异基因进行scale和主成分分析后,使用了两种方法降维。第一种是FItSNE,主要用于区分亚群;第二种方法是扩散映射,主要用于进行伪时间分析。接下来,使用DRAGON算法进行聚类。图1C为DRAGON确定的26个亚群FItSNE可视化结果。

FItSNE(https://github．com/KlugerLab/FIt-SNE):大大加快了计算时间,但其旨在检测离散的亚群,因此通常无法保留分化数据的连续轨迹。

扩散映射(Diffusion map embedding):能更好地保留全局结构和伪时间序列。

DRAGON:(https://github．com/arc85/dragonsc):结合了高斯混合模型和确定性退火聚类。不同于K均值聚类需要找类中心,高斯混合模型利用的是均值和标准差变化计算各变量的联系;确定性退火则是把细胞聚类最优化问题看作系统自由能最小化问题。

接下来采取的细胞注释策略是先分大类→再分小类。因为在高的温度下,想得到自由能最小,cluster之间的差别要很大,所以他先在较高的T值聚类出四类亚群:CD4 +T,B,细胞毒性细胞(CD8 + T和NK)和髓系细胞。然后根据已有的基因表达模式来细分细胞类型(图1D),并通过流式细胞术验证。还进行了第二次事后功效分析,验证细胞聚类的可靠性。图1E显示了不同样本来源的细胞情况。

为了量化HPV–和HPV + TILs主要免疫谱系的差异,使用巴氏距离(Bhattacharyya)(图1F)衡量了它们之间的差异。结果显示HPV–和HPV + TIL之间的B细胞,髓样细胞和CD4 +Tconv细胞之间存在较大差异。相反,CD8 + T细胞和CD4 +Treg细胞较相似。

图1． 评估患者之间转录特征的总体变化以及总体聚集和单细胞鉴定