2．CD8 + T细胞具有连续分化轨迹

接下来对CD8 + T细胞进行了生物信息学分离并重新聚类,得到了8个亚群(图2A)。TIL的CD8 + T最常见于#1-4,而PBMC和tonsil的CD8 + T细胞常见于#5-8(图2B)。图2C为每个亚群的差异基因。

图2C得:#1与细胞周期细胞(eg． MKI67)相关;#2与干扰素应答基因(eg． ISG15)相关;#3和4与检查点标记(eg． PDCD1,CTLA4和HAVCR2)相关;#5表达较为静止;#6与幼稚或记忆细胞(eg． CCR7和CD27)有关;#7与早期激活相关(eg． JUNB和FOSB);#8表达与效应功能有关(例如,KLRG1和GZMH)。

接下来,使用自主开发的新R包SingleSeqGset(https://github．com/arc85/singleseqgset)中进行竞争性基因集富集测试(competitive gene set enrichment test),评估了亚群的生物学功能。其中,#4缺氧反应有富集,而先前已经证实缺氧诱导因子可增强CD8 + T细胞效应,这表明该亚群抗肿瘤活性更高。

接下来,使用R包Destiny进行扩散映射分析(diffusion map analysis)来推断分化轨迹。结果显示出一条无分叉平滑轨迹(图2E),HPV +和HPV- TIL也有重叠(图2F)。因为DC1与抑制性受体表达以及腺苷代谢增强有关,所以认为DC1与终末分化表型密切相关 。总的来说,这个部分鉴定出CD8 + T各亚群功能,并根据HPV +和HPV-之间共有的分化轨迹,推断针对CD8 + T细胞的免疫治疗策略可能均适用于两种HNSCC。

图2．CD8 +T的HPV–和HPV + TIL分化轨迹以及抑制性受体的共表达

3．CD4 + Tconv的异质性和分化轨迹

接下来比较了HPV–和HPV + HNSCC之间CD4 + T细胞的转录情况,分别分析了CD4 + Tconv细胞和CD4 + Treg细胞。CD4 + Tconv细胞聚类出7个不同的亚群(图3AB),#1和6大部分由HPV + TIL和tonsil组成,HPV– TILs则分布在#4和7之间。基因富集发现tonsil和TIL中的CD4 + Tconv细胞显示出T滤泡辅助功能(TFH)和1型辅助功能(TH1)的富集,且HPV +与HPV– TIL相比,具有显著的细胞富集,说明HPV + T细胞的效应功能更强。

图3C为CD4 + Tconv细胞的分化轨迹,不同于CD8 + T细胞,扩散图的前3维产生了分支轨迹(图3C),且发现HPV–和HPV + TIL的分化平面显著不同(图4D)。接下来将扩散拟时间(pseudotime,DPT)作为第三维与DC1,DC2一起分析,DC1和DC2都与DPT正相关。与基因集富集分析一致,#2是最幼稚的亚群,然后通过连续的中间表型,向#1或#7终态发展。图3E显示了#1和7的差异基因表达,#1与TFH有关,#7与记忆性功能有关。CXCR5和PDCD1与DC1的表达有关,还发现了其他已知抑制性受体(LAG3和HAVCR2)在CXCR5和PDCD1共表达时明显表达。这表明了早期阶段的命运决定模式,过程中细胞可以发展为CD4 + TFH或者通过抑制受体共表达,从而潜在地抑制进一步分化。

图3．A-E CD4+ Tconv的转录状态和分化轨迹的分析

4．CD4 + Treg细胞中与IFN和TNFR相关的信号

CD4+ Treg细胞能抑制抗肿瘤免疫反应,其细胞聚类发现了6个亚群(图3FG),主要由TIL细胞构成。接下来,进行了基因集富集分析,以表征每个亚群的生物活动(图3H)。#2和4与IFNα应答相关,#3和6与TNFR家族信号通路相关,表明这些细胞根据其分化状态对不同的信号作出反应。

CD4 + Treg细胞的扩散映射图显示DPT与DC1密切相关(图3I)。沿着DC1轴,HPV–与HPV + TIL Treg细胞的密度存在细微差异,在早期DPT处,来自HPV– TIL的Treg细胞更多(图3J)。

然后还发现TNFR与DC1正相关,并在晚期DPT表达。相反,IFN反应基因IFITM1,IFIT1,IFIT3和ISG20在早期DPT时表达,并随着伪时间的进展而静止,表明IFN信号在Treg细胞的早期活化中具有潜在作用。综上所述,该分析表明,Treg细胞在HPV–和HPV + HNSCC之间具有相似的轨迹,并且在分化过程中IFN相关信号和TNFR家族信号相关,提示靶向Treg细胞的早期激活过程可以使用基于IFN的治疗,而晚期激活的Treg细胞可能对TNFR介导的信号传导更敏感。

图3．F-J CD4+ Treg细胞的转录状态和分化轨迹的分析