附图3：NSCLC样品中EC细胞的RNA原位杂交结果

作者使用飞行时间质谱分析（CyTOF），使用针对这些细胞的26种预选标记的金属结合抗体，对从NSCLC样品中新鲜分离的单个的癌症、EC和基质细胞中的标记基因的蛋白质水平进行了定量。

图3I－K：I：CyTOF数据的t－SNE图，以不同颜色区分基质和癌细胞表型 

J：通过CyTOF在基质细胞亚群中定量HLA－II表达 

K：通过scRNA－seq和CyTOF分析鉴定的EC表型的层次聚类 CyTOF识别的簇以蓝色表示。

图S4：A－B：根据CyTOF数据进行t－SNE后细胞的来源情况展示 

C－D：t－SNE中不同标记蛋白的表达 

E：EC表型指示标记蛋白的表达水平条形图 

F：hTECs和hPNECs中指示标记蛋白表达水平条形图

CyTOF单细胞数据的无偏聚类和t－SNE可视化揭示了EC，基质和癌细胞的独立簇（图3I和S4A–S4D）

与scRNA－seq一致，作者检测到I型（vWF－low）和II型（vWF－high）肺泡毛细血管EC，毛细血管后静脉EC（ACKR1－high ／ vWF－high）以及淋巴hPNEC和hTEC表型（PROX1－high）（图S4E）。

表达最高CXCR4（tip EC标记）水平但下调毛细血管标志物（CD36，CA4，HLA－II蛋白）的表型可能代表血管生成性hTEC。

检测到一个较弱的簇，作者将其认定为假定的活化毛细血管：与I型和II型毛细管相比，其毛细血管标志物（CA4，CD36，HLA－II）表达降低，但静脉TEC标志物vWF和tiphTEC标志物水平升高 CXCR4（图3J和S4E）。

CyTOF证实了毛细血管内皮细胞中HLA和CD36的水平升高，并在hTECs中被下调（图3J和S4F）。

为了验证使用scRNA－seq和CyTOF鉴定出的种群一致的观察结果，作者使用关键表面标记物（STAR方法）进行了层次聚类（图3K）。

LEC和毛细管EC聚集在一起，静脉EC与血管生成EC聚集在一起。

值得注意的是，多尺度自举分析表明，scRNA－seq解析的I型和II型毛细管EC最类似于其CyTOF对应物，这一结果在mRNA和蛋白质水平上交叉验证了2种不同的毛细血管表型的存在。

2．EC表型异质性可能的临床意义

尽管所有患者均未接受过早期治疗，作者仍在不同EC表型的相对分数中观察到了患者间异质性（图4A）。

在hPNEC中，检出的动脉，毛细血管，静脉和淋巴EC的比例各不相同，尤其是毛细hPNEC表型。

在hTECs中，毛细血管EC的数量减少了，这一结果已通过免疫组织化学证实（图4B）， 尽管每个患者的程度不同。

腺癌中不成熟的hTECs较鳞状细胞癌更为丰富。

图4：A：患者间EC表型的分布情况 

B：以CD31和CD36免疫染色的人肿瘤周围组织（上）和NSCLC肿瘤（下）照片及定量

为了将EC表型特异性基因标记的表达与NSCLC患者生存相关联，作者利用了癌症基因组图谱（TCGA）的1，024个NSCLC患者的bulk RNA－seq数据集。利用公开资源（STAR方法）为每种表型鉴定EC特异性标记基因集后，作者使用基因集变异分析（GSVA）对1，024个中的每个标记的富集程度进行NSCLC患者评分，并分组进行生存分析。

鳞状（但未见腺癌）的NSCLC患者中拥有表达高水平的血管生成tipEC，

未成熟，活化的毛细血管后EC或淋巴TECs基因组特征的部分，这些患者总生存期较短，可能是因为这些特征反映了活跃的血管生成和淋巴瘤传播（图4C）。

图4C：对于TCGA来源数据使用GSVA根据EC表型分组后生存分析结果3．其他物种和模型中的肺肿瘤EC表型

为了比较跨物种的肺TEC分类法和模型，以在整合一致性分析中识别常见的血管生成TEC表型和靶标，作者使用了与人类来源相似的分析策略来构建了另外2种肺TEC分类法，主要研究了两种模型中的TEC情况

显微分离的29，007个小鼠mNEC和mTEC，其中存在是否接受过抗VEGF治疗的分型

来自人肺肿瘤的6，512个培养的hcTEC。

这两者均来自于LLC模型，因为它依赖于血管生成血管萌芽（AAT的靶标），这与其他临床前小鼠NSCLC肿瘤模型不同。

与在人肺中一样，作者鉴定了富集到的mNEC的表型，这些表型分别表达动脉（M1），I型和II型肺泡毛细血管（M2，M3），静脉（M4）和淋巴性（M5）EC的典型标志物（图5A－5D和S5A  –S5G）。

图5：A：小鼠模型实验流程 B：不同来源的EC在t－SNE分布情况 

C：整合后的t－SNE图（对不同亚群进行颜色注释） 

D：t－SNE聚类后的亚群标记基因的表达分布情况

图S5：A：mTECs和mNECs中EC表型的相对丰度。 

BC：标记基因在不同亚组中的表达热图 

D：所有已鉴定的mNEC和mTEC表型的不同基因表达谱的相关性热图 

E：在hTECs和hpNECs不同EC亚型的占比 

F：hTEC和hpNEC对不同亚型的贡献情况

图S5：G：在患者标本中对于所有细胞的聚类结果 

H：mNEC和mTEC的t－SNE图（H2－Aa和H2－Ab基因的） 

在鼠肺EC表型中所示的常驻内皮干细胞（ESC）标志物表达水平的热图。 

J－K：Glycam1基因或HEV标记基因集的颜色编码的mNEC和mTEC的t－SNE图

II型肺泡毛细血管内皮细胞表达参与MHC－II抗原呈递，加工和负载的基因水平最高（图S5B和S5H），但不表达共刺激基因Cd80和Cd86。

与NSCLC一样，在肿瘤中毛细血管EC的比例不足（图S5A；表S3），mTEC中典型的毛细血管基因特征表达下调，包括MHC－II表达（图S5H）。

除了一个毛细血管TEC表型（M6）外，mTECs下调了Cd36（一种涉及脂肪酸摄取的基因）（图5D）

与人肺不同，鼠肺中的静脉EC表型表达了先前在大型肺血管中发现的常驻内皮干细胞标志物（Cd200， Bst1）（图S5I）。

检测到增殖的（M7）和tip的（M8）mTEC（图5C和5E）。鼠肺中增殖的mTECs比人肺肿瘤中的丰富，这与鼠肺肿瘤的更快生长以及NSCLC中可能的不同类型肿瘤血管形成相一致（图5D和S5E）。

检测到不成熟的mTEC表型（M9）（图5C）。

与人类EC一致，观察到高静脉可塑性并检测到TEC丰富的表型，包括大静脉EC（M10）和毛细血管后静脉EC（M11）（图5C）。