通过整合基因组分析以鉴定肺肿瘤内皮细胞异质性和血管生成候选物

2021-01-07 11:35

科研菌

关注

毛细血管后静脉mTECs上调了HEV标记（图S5J和S5K），通过免疫染色证实（图S6A和S6B）。

图S6：针对不同靶位的免疫染色的健康鼠肺（左）和鼠肺肿瘤切片（右）的免疫荧光照片

其余的鼠表型主要在mTECs中检测到（图5C和S5F）。

新指骨mTEC表型（M12）表达毛细血管和小动脉标记，而激活的动脉mTECs（M13）中观察到新动脉生成标记上调。

值得注意的是，只有mTECs，而不是mNECs，表现出以干扰素（IFN）响应和趋化因子的表达为特征的表型，参与免疫细胞募集和血管阻滞（M14）（图S5C）。

确定了以前无法识别的EC表型，作者将其称为突破细胞（M15），以及它们的推定前体，先裂解细胞（M16）（图5E－5G）。

突破细胞不仅上调TEC末端标记的表达，而且还上调VEGF诱导的足突玫瑰花介导的基底膜（BM）和胶原蛋白重塑的基因的表达。

免疫染色证实了蛋白质水平上的动脉，毛细血管，静脉和tipmNEC和mTEC表型的标志物表达（图S6C–S6J）。

在培养的hcTEC中，体内的动脉，毛细血管和静脉EC表型不再可检测到（图S7A和S7B）。

图S7：A：培养的hcTEC的聚类情况

B：标记基因在不同亚组中的表达热图

在hcTECs中可检测到典型的tipEC表型（C1），这是一种可塑瞬时表型（plastic transient phenotype ）。

如在培养中的EC繁殖中所预期的，检测到了增殖的hcTEC（C2）。可能与培养条件有关（存在转化生长因子b，血清中内皮－成纤维细胞转化的诱导剂）

鉴定到表现出内皮－间充质转化特征的表型（C3）（TAGLN，SERPINE1，FN1，CD44，）。

检测到一个上调核糖体基因的中间过渡表型（C4），表明EC表型正在采用另一种表型（图S7B）。

４．VEGF阻断剂对TEC表型差异敏感性的影响

使用mTEC分类法，作者探讨了特定的EC表型是否对抗VEGF AAT敏感（VEGFR2抗体［DC101］，VEGFR酪氨酸激酶抑制剂［PTK787］）（图5H）。这些化合物的剂量都达到抑制病理性血管生成并减少肿瘤中的EC数量的并抑制肿瘤的生长水平（图S7C）。

图5H：不同药物治疗后mTEC表型的相对组成

图S7：治疗后的肿瘤重量比较

对照和AAT处理后的EC依旧有相同的cluster组成（图5H），表明AAT不会改变不同EC表型的整体转录组特征。

对单个EC表型的量化显示，tip 和突破TECs最敏感。毛细血管后静脉和增殖的TEC对VEGF阻滞较不敏感，而毛细血管TEC对PTK787治疗较不敏感（图5H），尚不清楚这是否是由于肿瘤从血管发芽转变为血管选择所导致的。

5．肿瘤血管紊乱的分子特征和VEGF阻断的作用

肿瘤血管结构混乱且功能异常，但缺乏详细的无偏分子足迹分析。传统上，AAT被认为可以修剪血管生成的EC，VEGF阻断疗法也被认为可以使异常的血管系统正常化。

作者探讨了抗VEGF治疗是否通过诱导更细微的基因表达变化来达成EC阻滞作用：

首先通过在成对差异分析中比较血管生成和非血管生成的表型来构建“正常”和“肿瘤血管紊乱”的基因特征，以鉴定差异表达的基因（经校正的p值＜0．01，｜FC｜＞1．5）。比较发现分别有18个和28个基因的表达水平显著升高，分别处于紊乱（tip，突破和未成熟的EC标记基因）和正常（包括毛细血管标记基因）表型中（图5I，5J，S7D和表S4）。

图5：I：18个紊乱基因signature在不同处理组的表达水平

J：紊乱基因signature中的基因的表达水平（黑色虚线左侧）和正常的signature（黑色虚线右侧）的表达水平，药物处理对这些特征的影响

使用18个紊乱基因signature的GSVA显示，肿瘤血管的紊乱被VEGF阻断部分逆转（图5I和5J）。

图S7E－F：药物影响后的基因改变GSVA分析

两种VEGFR抑制剂均降低了末端EC基因signature的表达（糖酵解；BM重塑）

同时增加了与成熟的体内稳态功能相关的signature的表达（抗原呈递，屏障，和血管发育）（图S7E和S7F）。

因此，VEGF阻断不仅修剪，而且还调节了TECs以促进具有稳态功能的更静态和成熟的肿瘤脉管系统，表明部分肿瘤血管分子正常化。

6．保守的TEC表型和tip EC标记物的鉴定

先前的研究发现，替代性促血管生成信号的上调会使抗VEGF疗法的疗效受到耐药性的限制。

为了确定备选的血管生成候选物，作者假设跨物种和模型保守的TEC表型以及一致表达的基因可能是更稳定的血管生成候选物。

因此，作者进行了整合的单细胞转录组学，本体多组学和转录组学荟萃分析，以识别此类候选基因（图S8A）。

图S8A：整合分析流程

作者使用scRNA－seq数据来评估跨物种和模型的血管生成EC表型的相似性，使用标记基因集的成对Jaccard相似系数并应用主成分分析（PCA）进行可视化（图6A和S8A）。

图6A：针对跨物种的EC主成分分析

在体外，hcTECs失去了体内动脉，毛细血管和静脉的表型。体内hTECs和mTECs和末端EC转录组signature在培养的hcTEC中是保守的。

仅在培养的和小鼠的TEC以及某些NSCLC患者的hTEC中检测到具有增殖特征的EC。

新鲜分离的人静脉和鼠类未成熟TECs，以及中间的hcTECs高度表达核糖体基因，提示可塑性表型，并过渡到其他血管生成EC表型。

除了tip TEC ，其他表型都是模型或物种特异性的。由于tip TEC在所有测试的物种和模型中均表达了相似的标记基因标记，因此作者着重于确定一致的tip TEC标记。

为了构建tip TEC标记的排名列表，作者首先选择了296个保守的tip EC中富集的基因，这些基因在物种和模型的tip TEC中始终表达最高。

其次，对于每个保守基因，作者通过计算3个数据集中的每个标记基因等级的乘积来定义等级得分（在此列表中，始终在tip EC中上调最高的基因中的基因排名最高）（图 6B）。

图6B：保守的tip EC标记基因的一致性得分条形图

上图：按指示的生物学过程分类的50个排名最高的标记基因

下图：它们与基准数据集的交集

作者提取了在排名前50位的富集signature进行后续分析。

这些富集的signature包含了先前在tipEC中检测到的tip EC标记（ANGPT2，APLN，FSCN1，PGF，PLXND1，ADM，PDGFB，CXCR4等），但不一定在表达模式和功能水平上进一步表征。

50个排名最高的基因中有一半以前没有被描述为tip TEC标记（在肿瘤或生理性血管生成中EC的转录组学研究中未检测到）。

一致的末端TEC标记与迁移的末端EC表型相关，包括层粘连蛋白（LAMA4，LAMC1，LAMB1），基质细胞蛋白（SPARC，LXN），细胞骨架相关基因（VIM，MARCKS，MYH9，MYO1B）和细胞粘附分子（CD93， MCAM，ITGA5）。

确定了新的tip TEC丰富的转录因子（TCF4，SOX4，SMAD1）。

肿瘤中紊乱的血管结构阻碍了tipTEC的形态学鉴定：图S6J（见上）显示了tip EC标记物的异质表达，但标志物在肿瘤血管发芽的最前端及其在形态学tip EC中的表达不能被明确鉴定。

因此，作者使用了产后视网膜血管生成模型来验证LXN（Latexin）和FSCN1（Fascin）在血管前端的tipEC中的表达（图S8B）。为了证明其功能作用，作者研究了沉默这些tip细胞标记是否会影响tip细胞竞争能力。

图S8B：出生后第5天，固定物异凝集素B4染色指示脉管系统及LXN或FSCN1的免疫染色

作者沉默了人脐静脉EC（HUVEC；＞ 70％–80％的沉默效率；图S8C）中的LXN（［shRNA］敲低）或FSCN1（siRNA沉默）表达，并生成了包含1：1对照野生型HUVEC（红色）、FSCN1（绿色）和被LXN沉默的HUVEC混合物的镶嵌球体。沉默的细胞很少出现在尖端位置，这证实了这些标记物在tip EC中的作用（图6C和6D）。